原創(chuàng)： 肝膽蔣貝格Dr.李

作為全球致死率第二高的癌癥——肝癌，每年大概有76.5萬人因肝癌死亡。臨床實踐證明，肝癌成功切除后的預(yù)后，取決于早診斷。只要在極早期/早期被診斷出來肝癌，并加以有針對性的治療，肝癌的治愈率將會大大地提高。目前的肝癌篩查的方法有：血液AFP的檢測、腹部超聲、CT、MRI等檢查。雖然，上述方法能夠發(fā)現(xiàn)部分小的肝臟腫瘤，但是敏感性、特異性都較低，而且肝癌的良、惡性病變相對較難判斷。

微流控CTC-iChip系統(tǒng)

肝癌在癌變早期會有少量的肝癌細(xì)胞會隨著血液循環(huán)進(jìn)入血管中，但是由于細(xì)胞量很少，或者由于血液中有大量的紅細(xì)胞、白細(xì)胞等及其他臟器來源的細(xì)胞的干擾往往不能夠靈敏地、特異地檢測到肝癌細(xì)胞。最近，來自美國哈佛醫(yī)學(xué)院的Haber教授帶領(lǐng)的研究團隊發(fā)明了一種技術(shù)，能夠通過檢測血液中極微量的肝癌細(xì)胞來篩查肝癌的發(fā)生。該技術(shù)命名為微流控CTC-iChip系統(tǒng)（microfluidicCTC-iChip）。微流控CTC-iChip系統(tǒng)的工作原理：將抽提的血液放入CTC-iChip微流控裝置中，在CTC-iChip微流控裝置中首先根據(jù)細(xì)胞大小將血液中的紅細(xì)胞、血小板和血漿分離出去，然后利用結(jié)合有白細(xì)胞CD45、CD16和CD66B抗體的磁珠將白細(xì)胞分離出去，經(jīng)過CTC-iChip微流控裝置后血液循環(huán)中的癌細(xì)胞（circulatingtumorcells，CTCs）被富集；然后再通過檢測肝癌細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄子來判斷這些癌細(xì)胞是否來自肝臟（圖1）。

圖1.微流控CTC-iChip系統(tǒng)篩查血液中的肝癌的工作原理。CTC:circulatingtumorcell,血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞；WBC：whitebloodcell，白細(xì)胞。

微流控CTC-iChip系統(tǒng)的優(yōu)勢

特異性和靈敏性是肝癌篩選最關(guān)系的兩大問題，那么，微流控CTC-iChip系統(tǒng)是如何做到特異性和靈敏性的呢？

1.特異性

10個肝癌特異標(biāo)記分子確保特異性：每個細(xì)胞都有自己特異的分子來行使自己的功能，毫無疑問肝癌也存在自己特異的分子-即肝癌特異分子標(biāo)記物。對現(xiàn)已公開的微陣列數(shù)據(jù)庫中的2萬個基因進(jìn)行分析，挑選出在血液細(xì)胞、肝臟以外的臟器都不表達(dá)但是在大部分肝癌中高表達(dá)的100個基因。然后，利用CTC-iChip系統(tǒng)檢測分別檢測10個患有肝癌的病人和8個健康的志愿者的血液中上述得到的100個基因。通過比較分析，最終確定10個基因作為特異性檢測循環(huán)中的肝癌細(xì)胞（圖2）。

（注：10個基因為甲胎蛋白（Alphafetoprotein，AFP），a2-羥色胺糖蛋白（alpha2-HSglycoprotein，AHSG），白蛋白（albumin，ALB），載脂蛋白H（apolipoproteinH，APOH），脂肪酸結(jié)合蛋白1（fattyacidbindingprotein1，F(xiàn)ABP1），纖維蛋白原b鏈（fibrinogenbetachain，F(xiàn)GB），纖維蛋白g鏈（fibrinogengammachain，F(xiàn)GG），磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican3，GPC3），視黃醇結(jié)合蛋白4（retinolbindingprotein4，RBP4），和轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）。

圖2.微流控CTC-iChip系統(tǒng)能夠特異地識別肝癌細(xì)胞。

2.靈敏性

完整全轉(zhuǎn)錄組擴增和微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)提高檢測的靈敏性和特異性：將分選得到的CTC細(xì)胞作完整全轉(zhuǎn)錄組擴增（whole-transcriptomeamplification，WTA），經(jīng)完整全轉(zhuǎn)錄組擴增的cDNA分子被包裹在單個液滴中再通過液滴PCR擴增進(jìn)行定量分析判斷。為了證明上述技術(shù)的靈敏性，將1、3、5、10或50個HepG2細(xì)胞混入4毫升健康供體的血液，然后通過CTC-iChip系統(tǒng)檢測。發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能夠檢測到一個肝癌細(xì)胞，當(dāng)然肝臟特異基因信號會隨著細(xì)胞數(shù)量的增加而增加（圖3）。

圖3.餅圖顯示經(jīng)過完整全轉(zhuǎn)錄組擴增后可以提高檢測的靈敏性。

可見，該肝癌篩選系統(tǒng)有如下幾大優(yōu)勢：

1）無創(chuàng)檢測，檢測時只需要提取血液即可

2）特異性高

3）靈敏高，在肝癌的極早期就能夠檢測到

與傳統(tǒng)的肝癌篩查指標(biāo)（AFP）的比較：1、通過檢測兩名肝癌患者（編號分別為HCC-041和HCC-075），間隔1周抽取他們血液分別作CTC-iChip和血液AFP檢測，發(fā)現(xiàn)CTC評分（CTC-iChip檢測獲得的指標(biāo)）在兩個患者都很高，而血液AFP在HCC-075患者體內(nèi)沒有檢測到，說明CTC-iChip系統(tǒng)的特異性更高（圖4A）。2、兩個肝癌患者（編號分別為HCC-058和HCC-060）接受外科腫瘤切除術(shù)，利用CTC-iChip和血液AFP檢測進(jìn)行術(shù)后，結(jié)果顯示CTC評分更加靈敏（圖4B）。3、在接受免疫檢查點抑制劑（NIVolumab）治療后，HCC-042患者的CTC評分顯著下降，術(shù)后3wk進(jìn)一步縮小（圖4C）。值得一提的是，在這五位患者中有三位（HCC-042、HCC-058和HCC-075）血液中的AFP由于低于臨床檢測的最低值（<20ng/ml）而沒有檢測到。因此，盡管血清AFP蛋白經(jīng)常被用于肝癌患者的篩查，但是其檢測率很低。CTC-iChip系統(tǒng)極有可能成為一個更好地篩查、評價肝癌的一個檢測手段。

圖4.CTC評分較血液AFP檢測系統(tǒng)能夠更靈敏、更特異地檢測肝癌及監(jiān)控肝癌的治療情況。

微流控CTC-iChip系統(tǒng)的應(yīng)用

介于CTC-iChip系統(tǒng)的無創(chuàng)傷、高靈敏性、高特異的優(yōu)點，可以應(yīng)用到：

1）大規(guī)模的篩查肝癌

2）實時監(jiān)控肝癌的治療效果

3）評價肝癌的復(fù)發(fā)，痊愈情況

小結(jié)

全世界半數(shù)左右的肝癌病人集中在中國，占我國惡性腫瘤死亡率的第二位。肝癌早期診斷難，大多數(shù)HCC患者確診時一般已是中晚期；復(fù)發(fā)后轉(zhuǎn)移率高。假如能夠做到“早發(fā)現(xiàn)、早治療”肝癌的死亡率可能會大大降低。微流控CTC-iChip系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于其他癌癥的篩查。隨著技術(shù)的進(jìn)一步完善，希望該技術(shù)能夠用于肝癌的篩查、實時監(jiān)控肝癌的治療及治療療效的評價將極大提高肝癌的防治水平。

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