001.問：要怎么樣復蘇細胞？

答：細胞復蘇需要準備一個37℃水浴鍋、手套、鑷子，以及防護眼鏡。戴上手套，用鑷子夾住液氮罐中拿出的凍存管，然后快速在37℃水浴鍋里融解細胞。防護眼鏡可以防止液氮罐里剛剛拿

出來的管子液氮爆炸……

002.問：培養基不夠用，我能不能換一下細胞培養基啊？

答：千萬別這么做，細胞都有各自適應的培養基，萬一更換培養條件，細胞可能無法快速適應，導致細胞死亡。

003.問：那能不能換血清呢？

答：換的話，盡量換同一批次的血清，畢竟不同批次的血清，質量不一樣，所以可能會有潛在的影響，特別是更換血清品牌，需要用一批細胞進行預實驗，才行。

004.問：復蘇后應不應該立馬去除掉DMSO？

答：有一些細胞會對DMSO敏感，一般的培養條件來說，復蘇后的細胞（含有DMSO）加入完全培養基后培養，一天后再換液，可以避免復蘇后細胞的生長和粘附的問題。

005.問：什么時候需要換液？

答：這個要根據細胞的生長狀態來定，當細胞代謝加快后，應該換液。細胞密度增大后，需要考慮傳代。

006.問：培養基到底要不要加抗生素？

答：其實是不推薦加抗生素的，但是很多時候，都會為了保險，加上雙抗。但雙抗只能抗細菌，不能抗真菌哦！

007.問：啥時候用5%的CO2，啥時候用10%的CO2呢？有差別么？

答：當然有差別啦，主要看的是培養體系，培養基的緩沖體系基本上都是用碳酸氫鈉緩沖體系的，培養基里的碳酸氫鈉的濃度決定了CO2的量，當碳酸氫鈉達到3.7g/L的時候，需要采用10%的

CO2，當碳酸氫鈉達到1.5g/L的時候，需要用5%的CO2。如果你用的培養基用的是Hank's balanced salt solution (HBS，Hank緩沖液)的話，就不能用CO2培養箱了哦，因為這個體系里碳酸氫

鈉濃度只有0.35g/L。

008.問：培養基在冰箱里的時候，紫紅色的培養基為啥會變暗？

答：因為冰箱里沒有5%的CO2啊，培養基變成堿性，當然顏色就越來越暗了……

009.問：支原體污染是否能肉眼識別？

答：能，前提是你的眼睛有2000萬像素，以及4000倍放大變焦功能。一般來說，污染了支原體的細胞，生長狀態會變差，用肉眼基本很難判別到底是支原體污染還是你自己培養的時候在培養

基里多加了一把鹽……主要還是通過PCR檢測或者是染色檢測來區分支原體污染與否的。不過一旦污染，盡量丟棄，然后查看你的血清是否安全。

010.問：細胞離心的話要怎么離心？

答：有很多地方是國產離心機3000rpm離心3分鐘，當然，更推薦1000rpm離心5-10分鐘，這樣比較不容易傷害細胞。偷摸說一句，國產離心機的3000rpm未必能達到3000，所以問題并不大。

011.問：我細胞鋪板的時候量少點行不行？

答：可以，就是會長很慢……很慢……很慢……不知道有多慢的話，可以參考“克隆形成實驗”。細胞數量少或稀釋過多也是細胞生長的重要負面原因之一。

012.問：如何避免細胞培養過程中的污染？

答：主要還是考慮無菌環境，盡量做好操作臺的滅菌，別把培養基滴落在生物安全柜的入風口，別在培養箱里把培養基打翻。這兩個地方霉菌一旦滋生，那你就只能等著用甲醛熏蒸了。紫外無法殺滅霉菌，酒精也不行，只能用火，但是一定要注意安全。復蘇的時候，水浴鍋也需要進行滅菌處理。一旦出現污染，不要急，能救的就用抗生素救一下，但是一般情況下，選擇原諒……不是……是選擇扔掉……

013.問：我復蘇后的細胞死亡率高是啥原因？

答：有這樣幾個原因哈：1）培養基質量差，2）血清質量差，3）復蘇后立馬離心，導致大量細胞原地爆炸，3）細胞長時間放置在-80℃，4）誤把懸浮細胞當做是死細胞。

014.問：凍存管蓋子裂開是咋回事？

答：凍存管剛從液氮里拿出來的時候，手用力不均一很容易導致管子變形，導致管蓋受力凍裂，這個時候最好用鑷子夾住（有的地方推薦用止血鉗來夾）。凍存管取出后管蓋一定要擰緊，從液氮中取出后由于熱脹冷縮，管蓋很容易松動。這樣復蘇的時候，萬一有漏液，在水浴鍋里就會直接導致污染。

015.問：培養基里L-谷氨酰胺是干嘛用的？

答：L-谷氨酰胺的主要作用是在培養細胞的能量來源，參與蛋白質合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在一段時間內會在溶液中降解，但確切的降解率確實不清楚。 L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，氨對一些細胞有毒性。

016.問：培養基里的粉紅是干嘛用的？

答：主要為了顏色好看，引起食欲……個鬼……酚紅一般作為培養基中pH值的指標：當培養基呈中性時為紅色，呈酸性時為黃色，堿性時為紫色。另外，酚紅可以模擬類固醇激素（特別是雌激素）的作用。如果要避免類固醇反應，可以在無酚紅的培養基里進行培養。

017.問：胰酶里為啥要加EDTA？

答：二價的離子會抑制胰酶活性，所以加入EDTA可以螯合掉Ca、Mg這樣的二價離子。胰酶也要注意不要反復凍融哦！

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