目前臨床微生物的檢測(cè)以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為主，通過(guò)樣本接種、培養(yǎng)，分離單菌落后，通過(guò)形態(tài)、生化反應(yīng)或質(zhì)譜鑒定菌種，進(jìn)而通過(guò)紙片法、E-test或微量肉湯稀釋法獲得藥敏結(jié)果。這種傳統(tǒng)培養(yǎng)-鑒定-藥敏的方式，雖然結(jié)果可靠，微生物實(shí)驗(yàn)室的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但手工操作復(fù)雜、出結(jié)果時(shí)間長(zhǎng)，人工成本和時(shí)間成本成為了微生物發(fā)展的重要制約因素。難以做到入院常規(guī)篩查病原體，易導(dǎo)致漏檢，且感染患者也難以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)治療效果；臨床重癥患者通常只能經(jīng)驗(yàn)用藥，在2-3天獲得病原學(xué)依據(jù)后再按需調(diào)整抗生素，易導(dǎo)致用藥無(wú)效、誘導(dǎo)耐藥、過(guò)度醫(yī)療等情況，患者增加醫(yī)療花費(fèi)，造成較大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

反觀臨床生化實(shí)驗(yàn)室，在20世紀(jì)80年代時(shí)也是手工單樣本操作，但20世紀(jì)90年代以后，臨床開(kāi)始應(yīng)用生化流水線，樣本檢測(cè)效率極速提升，出現(xiàn)了質(zhì)的飛躍，大大促進(jìn)了檢驗(yàn)發(fā)展進(jìn)程。而臨床微生物領(lǐng)域的檢測(cè)場(chǎng)景，目前仍需大量人力和時(shí)間，那么是否能如生化實(shí)驗(yàn)室一樣，達(dá)到自動(dòng)化檢測(cè)水平？哪種檢測(cè)技術(shù)具有病原體快速鑒定和藥敏的優(yōu)勢(shì)？又能兼顧高敏感性和特異性？對(duì)于微生物檢測(cè)而言，快檢的主要關(guān)鍵問(wèn)題在哪個(gè)環(huán)節(jié)？以上均是微生物實(shí)驗(yàn)室面臨的挑戰(zhàn)，也是需要回答的問(wèn)題。

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室有哪些快速病原體鑒定和藥敏的檢測(cè)技術(shù)？微流控技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是什么？  

理想的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)包括幾個(gè)層面：快速、精準(zhǔn)、自動(dòng)化、能夠獲得表型藥敏等。在鑒定方面，目前微生物實(shí)驗(yàn)室可以進(jìn)行快速病原體鑒定的技術(shù)，除傳統(tǒng)方法外，還包括PCR、基于免疫的檢測(cè)、熒光原位雜交、微流控芯片技術(shù)等。各方法的比較見(jiàn)下表1。

在藥敏方面，近年出現(xiàn)了各類新興的快速藥敏檢測(cè)方法，包括細(xì)菌納米運(yùn)動(dòng)檢測(cè)技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、表面增強(qiáng)的拉曼光譜法、單細(xì)胞形態(tài)分析技術(shù)、流式細(xì)胞分析法、DNA微陣列、多重芯片技術(shù)、PCR/real-time PCR、基因組測(cè)序等，見(jiàn)表2。但以上分子類的方法僅能檢測(cè)藥敏基因型，不能檢測(cè)藥敏表型，而基因型是否與表型一致，還需進(jìn)一步驗(yàn)證；其他藥敏表型的診斷技術(shù)，一般又需分離純菌落測(cè)定，使檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)。

綜上比較，微流控技術(shù)不論在鑒定抑或藥敏方面，均具有較明顯的優(yōu)勢(shì)。可應(yīng)用樣本同時(shí)進(jìn)行病原體的鑒定和表型藥敏，可3h內(nèi)完成測(cè)定；操作具有便捷性；目前該技術(shù)雖未完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，但自動(dòng)化已在發(fā)展進(jìn)程中，也已出現(xiàn)了掌上微流控設(shè)備，達(dá)到一體化前處理、鑒定和藥敏的目的。對(duì)于低濃度菌量的問(wèn)題，通過(guò)微流控捕獲使細(xì)菌富集，可達(dá)到體系檢測(cè)閾值，具體在后文闡述。

表1微生物實(shí)驗(yàn)室快速病原體鑒定技術(shù)的比較

表2 微生物實(shí)驗(yàn)室快速病原體藥敏技術(shù)的比較

微流控技術(shù)通過(guò)什么原理進(jìn)行檢測(cè)？

電化學(xué)微流控技術(shù)，應(yīng)用生物傳感器進(jìn)行病原體檢測(cè)。優(yōu)勢(shì)是結(jié)合“基因型+表型”共同特點(diǎn)，不需基因擴(kuò)增，檢測(cè)細(xì)菌16sr RNA鑒定病原體，擁有分子檢測(cè)的敏感性和特異性；并監(jiān)測(cè)表型藥敏結(jié)果。檢測(cè)原理是：樣本NaOH前處理使細(xì)菌裂解后，病原體核酸釋放，結(jié)合于包被了探針的檢測(cè)芯片，通過(guò)特異性捕獲探針-病原體16sr RNA-特異性檢測(cè)探針組合，形成“三明治”結(jié)構(gòu)，其中檢測(cè)探針上標(biāo)記了熒光素的辣根過(guò)氧化物酶，在TMB（電子介質(zhì)）作用下，氧化還原H2O2（反應(yīng)底物），生成電子，可產(chǎn)生電信號(hào)大小與病原體含量呈正比，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，在電流檢測(cè)裝置中，1分鐘即可讀取電流信號(hào)值1（圖1）。16通道芯片，可根據(jù)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)不同探針，同時(shí)進(jìn)行多重病原體的檢測(cè)。由于檢測(cè)過(guò)程無(wú)需經(jīng)過(guò)擴(kuò)增，使整體反應(yīng)和檢測(cè)時(shí)間大大縮短，將鑒定時(shí)間，由傳統(tǒng)培養(yǎng)法的18 h縮短為1 h，且操作便捷。

圖1 電化學(xué)微流控技術(shù)原理  

注：A圖為檢測(cè)芯片結(jié)構(gòu)，芯片上包被各類細(xì)菌種屬特異性捕獲探針，與細(xì)菌16sr RNA、以及檢測(cè)探針相結(jié)合，形成特異性捕獲探針-16sr RNA-捕獲探針復(fù)合物，即“三明治”結(jié)構(gòu)。B圖局部放大，顯示此“三明治”結(jié)構(gòu)在酶促底物作用下，生成電流，最終通過(guò)測(cè)定電流信號(hào)值大小，進(jìn)行病原體種類和定量判斷。

微流控技術(shù)為何能夠獲得表型藥敏結(jié)果？

表型藥敏是臨床用于判斷細(xì)菌耐藥性的金標(biāo)準(zhǔn)，電化學(xué)微流控技術(shù)檢測(cè)細(xì)菌16sr RNA，因16sr RNA是細(xì)菌生長(zhǎng)復(fù)制活躍的標(biāo)志，只有生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)菌才能被識(shí)別檢測(cè)，在該技術(shù)中呈現(xiàn)電流信號(hào)的變化。分析樣本在抗生素作用下電流信號(hào)值的變化趨勢(shì)，獲得藥敏結(jié)果。樣本與待檢測(cè)抗生素短時(shí)孵育，敏感菌株生長(zhǎng)抑制、菌量減少；反之，耐藥菌株的菌量呈增多的趨勢(shì)。電流信號(hào)升高或降低的變化，即對(duì)應(yīng)細(xì)菌生長(zhǎng)或抑制趨勢(shì)，明確細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性，檢測(cè)的結(jié)果反應(yīng)的是細(xì)菌表型生長(zhǎng)特征。這類藥敏檢測(cè)兼具了16sr RNA探針基因的特異性，以及表型藥敏的穩(wěn)定性。

目前，電化學(xué)微流控體系也出現(xiàn)了熒光檢測(cè)的整合平臺(tái)，通過(guò)測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)弱變化，明確表型藥敏結(jié)果（圖2）。通過(guò)熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)，能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞層面的藥敏分析。

目前傳統(tǒng)微生物藥敏檢測(cè)時(shí)間約為48 h，電化學(xué)微流控體系僅需短時(shí)與抗生素孵育后進(jìn)行監(jiān)測(cè)，不需分離純培養(yǎng)物，可直接應(yīng)用樣本檢測(cè)，將藥敏時(shí)間縮短為3 h以內(nèi)。

圖 2  快速細(xì)菌鑒定和表型藥敏的電化學(xué)體系

該微流控體系可檢測(cè)樣本實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞層面的鑒定，并且進(jìn)行表型藥敏。將樣本滴加在微流控裝置中，加入探針并與抗生素混合。結(jié)合細(xì)菌16sr RNA檢測(cè)靶點(diǎn)，測(cè)定熒光信號(hào)的探測(cè)器分析。通過(guò)分析對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化，明確抗生素敏感性。  

微流控體系為何具有高敏感性和高特異性？

對(duì)于生物傳感器的識(shí)別元件，微流控體系中采用核酸適配體（即16sr RNA核酸探針，結(jié)合細(xì)菌的16sr RNA片段），生成電信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)電流值大小明確信號(hào)強(qiáng)度。相比其他生物傳感器識(shí)別元件，如抗體、抗菌肽、生物小分子及化合物、凝集素、分子印跡聚合物等，核酸適配體具有更高的特異性。

電化學(xué)微流控方法是一種分子診斷技術(shù)，即將標(biāo)記了熒光基團(tuán)的線性探針直接和細(xì)菌16srRNA雜交，產(chǎn)生電流信號(hào)。由于一個(gè)細(xì)菌內(nèi)部存在大量rRNA（約103-105個(gè)），即無(wú)需擴(kuò)增，也能保證反應(yīng)的敏感性，這也是該技術(shù)直接可應(yīng)用臨床樣本，不需分離純菌株，即可進(jìn)行特異性病原體鑒定的原因；也解釋了為何不經(jīng)擴(kuò)增，即可達(dá)到普通PCR反應(yīng)檢測(cè)的敏感性。

但由于RNA穩(wěn)定性較差，為提高探針的穩(wěn)定性，將核酸探針更換為肽核酸探針，后者指蛋白和核酸的雜合物，這類探針可與DNA或RNA分子形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合體，由于既不是純核酸也不是純蛋白，因此該復(fù)合物同時(shí)具有抑制核酸酶和蛋白酶降解的能力，并具有熱穩(wěn)定性，也可增加雜交率。探針經(jīng)修飾改良后，微流控體系同時(shí)具備了敏感性、特異性和穩(wěn)定性。

微流控技術(shù)的臨床應(yīng)用如何？鑒定和藥敏結(jié)果是否可靠？

微流控技術(shù)直接應(yīng)用臨床樣本，進(jìn)行樣本中病原體的鑒定和藥敏。現(xiàn)在已應(yīng)用的臨床場(chǎng)景包括尿路感染，血流感染等。

在鑒定方面， 16通道的芯片，可針對(duì)檢測(cè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)不同特異性探針，能夠同時(shí)鑒定并定量。應(yīng)用尿液樣本，對(duì)臨床常見(jiàn)的腸桿菌，非發(fā)酵菌，腸球菌等測(cè)定。以傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為標(biāo)準(zhǔn)方法，對(duì)微流控技術(shù)檢測(cè)結(jié)果比較，分析其敏感性為89%，特異性達(dá)到100%。對(duì)尿液樣本檢測(cè)限達(dá)到104CFU/ml，達(dá)到臨床對(duì)尿路感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)。針對(duì)模擬血流感染樣本，對(duì)腸桿菌、葡萄球菌、非發(fā)酵菌等，同樣可以準(zhǔn)確鑒定。并且電化學(xué)微流控在1h內(nèi)，即可獲得病原體鑒定結(jié)果。

在藥敏方面，直接與抗生素混合進(jìn)行電流值的測(cè)定。多通道芯片可混合不同種類的抗生素，通過(guò)電流值的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，同時(shí)獲得多種抗生素，如青霉素類、喹諾酮類、磺胺類等的藥敏結(jié)果（圖3、圖4）。應(yīng)用臨床尿液樣本，以微量肉湯稀釋法為標(biāo)準(zhǔn)方法，分析電化學(xué)技術(shù)對(duì)藥敏檢測(cè)的準(zhǔn)確度，每種抗生素的準(zhǔn)確性均達(dá)到90%以上，重大錯(cuò)誤率為4%，極重大錯(cuò)誤率1%，基本符合微生物性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)（其中僅重大錯(cuò)誤率略高于3%的標(biāo)準(zhǔn)）。微流控技術(shù)應(yīng)用臨床樣本，3h即可獲得初步表型藥敏結(jié)果。

圖3  電化學(xué)微流控對(duì)尿液樣本快速藥敏的電流-時(shí)間變化趨勢(shì)

患者尿液與抗生素作用后形成的電流信號(hào)值，在無(wú)抗生素（紫線）、氨芐西林（紅線）、環(huán)丙沙星（綠線）和復(fù)方新諾明（藍(lán)線）藥物中生長(zhǎng)曲線。每15 min檢測(cè)1次大腸埃希菌16sr RNA，電化學(xué)微流控的快速藥敏結(jié)果和臨床傳統(tǒng)方法VITEK2 板卡的結(jié)果一致。AMP氨芐西林，CIP環(huán)丙沙星，SXT復(fù)方新諾明。

圖4  電化學(xué)微流控對(duì)臨床尿液樣本的快速初步藥敏結(jié)果

尿路感染患者臨床樣本，應(yīng)用電化學(xué)微流控系統(tǒng)，進(jìn)行快速病原體鑒定和初步藥敏。結(jié)果顯示，該樣本為大腸埃希菌陽(yáng)性，且濃度約為105cfu/ml；常用抗生素中，頭孢類抗生素敏感。整個(gè)過(guò)程在3h內(nèi)完成。

NC陰性對(duì)照，EF糞腸球菌，EC大腸埃希菌，KP肺炎克雷伯菌，PA銅綠假單胞菌，PM奇異變形桿菌，EB腸桿菌目，UNI泛指所有細(xì)菌。

POS陽(yáng)性對(duì)照，SXT復(fù)方新諾明，CIP環(huán)丙沙星，AMP氨芐西林，AXO頭孢曲松，GEN慶大霉素，EFP頭孢吡肟。

快速檢測(cè)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和面臨的問(wèn)題是什么？微流控技術(shù)是如何解決的？

關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是對(duì)樣本的前處理，微流控技術(shù)應(yīng)用化學(xué)法，即溶菌酶和NaOH裂解樣本中的病原體，在8min內(nèi)達(dá)到釋放核酸的目的。已應(yīng)用在臨床尿液樣本，以及血液樣本的檢測(cè)，并分別明確了其適用性。

其次，對(duì)于復(fù)雜樣本，需充分考慮基質(zhì)的影響因素。如血液樣本，存在復(fù)雜的基質(zhì)效應(yīng)和背景；尿液樣本中的PH值范圍差異較大，呼吸道樣本的黏性高，等等。如應(yīng)用芯片和生物傳感器進(jìn)行檢測(cè)，需要避免基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的影響。通過(guò)模擬血流樣本，應(yīng)用微流控檢測(cè)多種細(xì)菌，包括大腸埃希菌，銅綠假單胞菌，金黃色葡萄球菌等，通過(guò)分析電流信號(hào)值，明確對(duì)于全血的檢測(cè)，背景值<25 nA，特異性靶點(diǎn)的檢測(cè)，陽(yáng)性閾值為100 nA，能夠區(qū)分陽(yáng)性信號(hào)，說(shuō)明背景的基質(zhì)效應(yīng)，不影響微流控檢測(cè)結(jié)果的判讀。對(duì)于尿液檢測(cè)，已通過(guò)100余例樣本，明確敏感性89%、特異性100%，說(shuō)明尿液PH值的差異性并非影響電流信號(hào)值的主要因素。

另外，對(duì)于菌量低的樣本，如何富集細(xì)菌，達(dá)到技術(shù)的檢測(cè)限也是難點(diǎn)之一。由于血液中菌量可低至1-10cfu/ml，而微流控裝置測(cè)定菌量起始濃度范圍是104-108CFU/ml，需通過(guò)前處理的富集，使檢測(cè)限達(dá)到樣本濃度的需求。對(duì)全血樣本，通過(guò)葡聚糖沉淀紅細(xì)胞，血漿再經(jīng)離心，可20 min內(nèi)快速富集血液中的細(xì)菌，達(dá)到即使血液中菌量濃度低至10cfu/ml，也可被微流控裝置捕獲，再次提高檢測(cè)的敏感性。甚至通過(guò)微流控裝置監(jiān)測(cè)在抗生素作用下，單個(gè)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，即可在1h左右即獲得單細(xì)胞層面的表型藥敏結(jié)果，使其能夠達(dá)到血液感染樣本低濃度菌量的檢測(cè)需求（圖5）。

圖5   微流控技術(shù)監(jiān)測(cè)單細(xì)胞層面的表型藥敏

單個(gè)大腸埃希菌在微流控通道中，分別加入不同濃度的抗生素。紅色箭頭指向細(xì)菌所在位置，在低濃度氨芐西林（<2 μg/ml）作用下，細(xì)菌生長(zhǎng)；高濃度（8 μg/ml）時(shí)，細(xì)菌裂解。比例尺5 μm。

微流控技術(shù)結(jié)合了“基因型+表型”的優(yōu)勢(shì)，即獲得分子檢測(cè)的敏感性，同時(shí)獲得表型藥敏。這種術(shù)既滿足了臨床對(duì)檢測(cè)時(shí)間的要求（1h可獲得鑒定結(jié)果，3小時(shí)可獲得藥敏）；也滿足了實(shí)驗(yàn)室對(duì)操作便捷的需求。可不經(jīng)分離純菌落，直接應(yīng)用臨床原始樣本進(jìn)行檢測(cè)，將傳統(tǒng)微生物鑒定時(shí)間，由18h縮短至1小時(shí)；將獲得藥敏的檢測(cè)時(shí)間，由48 h縮短至3小時(shí)，且達(dá)到單細(xì)胞監(jiān)測(cè)層面。擁有多通道的芯片體系，可多重檢測(cè)，且逐步在實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的檢測(cè)進(jìn)程中。微流控技術(shù)快速為臨床提供病原學(xué)診斷依據(jù)，可提高臨床診治效率，降低血流感染患者病死率；同時(shí)通過(guò)減少不必要的抗生素花費(fèi)，減少社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。未來(lái)可以充分發(fā)揮靈活設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)，繼續(xù)探究該技術(shù)在真菌、分枝桿菌等其他病原體的檢測(cè)的能力。

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