所有的生物芯片技術(shù)都包含四個基本要點：芯片的制作、雜交或反應(yīng)、測定或掃描、數(shù)據(jù)處理。生物芯片的技術(shù)核心是芯片的制備及反應(yīng)信號的檢測。

1、芯片制備技術(shù)

目前制備芯片的方法基本上可分為兩大類：一類是原位合成(in situ Synthesis)；一類是合成后交聯(lián)(post-synthesis attachment)。原位合成是目前制造高密度寡核苷酸芯片最為成功的方法。在制備基因芯片時要考慮陣列的密度、再生性、操作的簡便性、成本的高低等幾方面的因素。

具體而言，比較典型的DNA芯片制備方法有4種：第一種方法是Affymetrix公司開發(fā)的光引導(dǎo)原位合成法，該方法是微加工技術(shù)中光刻工藝與光化學(xué)合成法相結(jié)合的產(chǎn)物。第二種方法是Incyte Pharmaceutical公司采用的化學(xué)噴射法，該方法是將合成好的核昔酸探針定點噴射到芯片上并加以固定化來制作DNA芯片。

第三種方法是斯坦福大學(xué)研制的接觸式點涂法。在DNA芯片制備中通過高速精密機械手的精確移動讓移液頭與玻璃芯片接觸，而將DNA探針涂敷在芯片上。第四種方法是通過使用4支分別裝有A，T，G，C核昔的壓電噴頭在芯片上并行地合成出DNA探針。

光引導(dǎo)合成法與噴墨打印法、合成點樣法相比，最大的優(yōu)點是，它可以合成密度極高的陣列；但它的最大缺點是耗時、操作復(fù)雜，而且為保證在不同位點加上不同的單體，從而在不同的位點合成不同的探針，需要不斷更換不同的蔽光膜，對一個含25個堿基的探針的微陣列，一般需更換100個蔽光膜，需一天多的時間才能完成。

合成點樣法雖然芯片上探針的密度相對較低，每個樣品都要預(yù)合成、純化，在芯片制備前還需妥善保存合成的探針，但是它的最大優(yōu)點是操作簡便。目前很多公司采用這種方法來制備芯片。

2、樣品制備技術(shù)

生物樣品往往是各種組分的混合體，成分非常復(fù)雜，由于目前的檢測體系還不能檢測出未擴增的標記樣品，所以待測樣品DNA在雜交前一般都要進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，在擴增的過程中，對靶DNA進行標記。

目前DNA樣品的擴增一般是通過液相反應(yīng)來完成，但由于低濃度核酸很難檢測到，在溶液中通過PCR反應(yīng)獲得線性擴增也很困難；另外，不同靶DNA對引物的競爭，意味著某一序列的擴增優(yōu)于其他序列。

為了解決上述問題，一些公司正在研究新的方法。如固相PCR系統(tǒng)，該系統(tǒng)是將2種引物排列在丙烯酰胺膜上，與DNA樣品、PCR試劑混合，如樣品含有靶序列，則開始擴增反應(yīng)；通過這種固相PCR體系，可避免對引物的競爭，同時也降低了遺留污染。

不過也有不少人試圖繞過樣品擴增這一問題，如 Mosaic Technologies 公司引入的固相 PCR 方法，引物特異性強，無交叉污染并且省去了液相處理的煩瑣； Lynx Therapeutics 公司引入的大規(guī)模并行固相克隆法 (Massively parallel solid-phase cloning) ，可在一個樣品中同時對數(shù)以萬計的 DNA 片段進行克隆，且無需單獨處理和分離每個克隆。

在芯片飛速發(fā)展的今天，樣品制備已經(jīng)成為芯片發(fā)展的瓶頸所在。對于較大規(guī)模制作芯片的用戶，由于點樣樣品數(shù)目太多，即使采用高通量試劑盒還是不夠方便。

世界上聲譽卓著的核酸純化供應(yīng)商德國QIAGEN公司推出了全自動核酸和蛋白純化工作站，該工作站有4個不同的自動純化系統(tǒng)型號：BioRobot 8000，BioRobot 3000，BioRobot 9604，BioRobot 9600，加上QIAGEN優(yōu)質(zhì)的多種配套純化試劑盒--從質(zhì)粒、粘粒、RNA、血液基因組DNA、病毒DNA到蛋白，品種豐富，在歐美的生物醫(yī)學(xué)市場上掀起了一場革命，各大分子生物學(xué)中心、芯片中心、醫(yī)學(xué)中心爭相搶購。

樣品獲得后要進行標記，目前樣品的標記主要是熒光標記。熒光標記基本分為2種，一種是使用熒光標記的引物，一種是使用熒光標記的三磷酸脫氧核糖核苷酸。

目前常使用的熒光物質(zhì)有：熒光素、羅丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根據(jù)擴增產(chǎn)物分離的方法不同，標記的方法也不同：進行單引物標記的，其擴增產(chǎn)物通常由聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；

對一個引物用生物素標記，另一個引物用熒光素標記的，一般用親合素偶聯(lián)的磁珠捕捉其擴增產(chǎn)物，通過變性處理使熒光標記的產(chǎn)物解鏈。

此外，也有用生物素殘基標記引物，將生物素標記的擴增產(chǎn)物與芯片雜交，洗滌后加入親合素連接的熒光物，通過生物素與親合素的結(jié)合及靶序列與探針的結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，然后利用熒光檢測系統(tǒng)對熒光信號進行檢測。

3、芯片點樣技術(shù)

點樣法是將預(yù)先通過液相化學(xué)大量合成好的探針、或PCR技術(shù)擴增cDNA或基因組DNA經(jīng)純化、定量分析后，通過由陣列復(fù)制器（arraying and replicating device，ARD）或陣列點樣機（arrayer）及電腦控制的機器人，準確、快速地將不同探針樣品定量點樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應(yīng)位置上（支持物應(yīng)事先進行特定處理，例如包被以帶正電荷的多聚賴酸或氨基硅烷），再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。

點樣的方式分兩種，其一為接觸式點樣，即點樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上；其二為非接觸式點樣，即噴點，它是以壓電原理將DNA樣品通過毛細管直接噴至固相支持物表面。打印法的優(yōu)點是探針密度高，通常1平方厘米可打印2,500個探針；缺點是定量準確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限。噴印法的優(yōu)點是定量準確，重現(xiàn)性好，使用壽命長；缺點是噴印的斑點大，因此探針密度低，通常只有1平方厘米400點。點樣機器人有一套計算機控制三維移動裝置、多個打印/噴印頭、一個減震底座，上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。

現(xiàn)在已經(jīng)有比較成型的點樣裝置出售，例如美國Biodot公司的“噴印”儀，以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”儀。這些自動化儀器依據(jù)所配備的“打印”或“噴印”針將生物大分子從多孔板吸出直接“打印”或“噴印”于芯片片基上。“打印”時針頭與芯片片基表面發(fā)生接觸而“噴印”時針頭與片基表面保持一定的距離。所以，“打印”儀適宜制作較高密度的微陣列（例如2500點/cm2），“噴印”法由于“噴印”的斑點較大，所以只能形成較低密度的探針陣列，通常400點/cm2。點樣法制作芯片的工藝比較簡單便于掌握、分析設(shè)備易于獲取，適宜用戶按照自己的需要靈活機動地設(shè)計微點陣，用于科研和實踐工作。目前，除了在生物芯片研制方面享有盛譽的Affymetrix公司等個別公司使用原位合成技術(shù)制造芯片外，大多中小型公司普遍采用點樣技術(shù)制作生物芯片。

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