微流控芯片上酶和免疫反應(yīng)

1. 微流控芯片上非均相酶和免疫反應(yīng)

芯片上酶和抗體的固定化就是通過(guò)化學(xué)或物理方法 ,使原來(lái)水溶性的酶或抗體與聯(lián)結(jié)在微管道管壁的水不溶性固態(tài)支持物相結(jié)合或被載體包埋。固定方法有物理吸附、交聯(lián)、共價(jià)結(jié)合及包埋法等。酶和抗體經(jīng)固定化處理后一般穩(wěn)定性有較大提高 ,可重復(fù)利用 ,分析成本降低 ,而且適于連續(xù)自動(dòng)分析。與電極表面、孔板、磁性微珠、玻璃管等敞開(kāi)體系中蛋白質(zhì)固定不同,在微尺寸封閉體系的芯片微管道中固定酶或抗體,操作難度更大;而微流控芯片上酶和抗體的固定化對(duì)微管道的構(gòu)型要求不高 ,往往直接采用常規(guī)的T型和Y型微管道。因此 ,研究的重點(diǎn)在于如何有效地實(shí)現(xiàn)酶和抗體的固定化 ,目前僅有為數(shù)不多的酶或抗體固定方法成功地轉(zhuǎn)移到了微流控芯片上[13 ] 。

（1）馬來(lái)酐衍生物或戊二醛固定酶

戊二醛或馬來(lái)酐衍生物是研究得較為深入的酶 或抗體的交聯(lián)劑。其中戊二醛處理過(guò)的載體具有醛 功能模板 ,與蛋白質(zhì)分子發(fā)生不可逆共價(jià)結(jié)合 ,而馬 來(lái)酐衍生物使蛋白質(zhì)分子與載體以肽鍵方式結(jié)合。 Lee 等 [14 ]分別用這兩種固定方法 ,將大豆過(guò)氧化物 酶(soybean peroxidase ,SBP) 固定在修飾的玻璃材質(zhì) T 型微管道表面 ,進(jìn)行了對(duì)甲酚的雙氧水酶催化氧化 反應(yīng) ,并同時(shí)固定脂肪酶ΠSBP ,實(shí)現(xiàn)了微流控芯片上 對(duì)甲苯基醋酸鹽的多級(jí)酶催化氧化反應(yīng)。也有報(bào)道 用 APTES (32aminopropyltriethoxysilane) [15 ] 對(duì)玻璃或 PDMS 管道表面進(jìn)行氨基功能化處理 ,然后再通過(guò) 與羧基的共價(jià)結(jié)合來(lái)固定抗體。

（2）溶膠2凝膠固定化酶

溶膠2凝膠固定化酶是將酶分子固定在高聚物 格子里 ,這種固定化酶的機(jī)械強(qiáng)度較大 ,酶分子不易 脫落。Kato 等 [16 ]在標(biāo)準(zhǔn) DNA 分析芯片的進(jìn)樣儲(chǔ)液 池中制備豬胰島素膠囊凝膠來(lái)固定胰蛋白酶 ,進(jìn)行 了精氨酸乙酯和酪蛋白的水解及在線的熒光檢測(cè)。 Jin 等 [17 ]利用凝膠微珠固定胰蛋白酶 ,進(jìn)行酶的水 解及電泳分離和質(zhì)譜檢測(cè)。Huang 等 [18 ] 利用比表面 積較大的納米粒子對(duì) PMMA 管壁進(jìn)行修飾后 ,通過(guò) 凝膠固定胰蛋白酶[19 ] 。

（3）微珠固定酶或抗體

磁性高分子微球是指內(nèi)部含有磁性金屬或金屬 氧化物的超細(xì)粉末而具有磁響應(yīng)的高分子微球。它是近20年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型高分子材料 ,除了具有 納米顆粒的特性外,還可以通過(guò)表面的官能團(tuán)進(jìn)行各種功能修飾,用來(lái)固定酶或抗體,而且表面具有磁性,在外加磁場(chǎng)的作用下可以進(jìn)行分離,用于蛋白質(zhì)的分離和純化,因此在生物樣品分析提純和臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。目前在微流控芯片上微球主要是作為酶或抗體的載體,發(fā)展成熟的磁性微球或沒(méi)有磁性的玻璃微球在微流控芯片上都有應(yīng)用[20 —22] 。

磁性瓊脂糖微珠被 Srinivasan 等 [23 ]用來(lái)在 PDMS 微管道內(nèi)固定 Pikc 羥化酶 ,進(jìn)行鐵氧化還原蛋白催 化大環(huán)內(nèi)脂化合物的羥化反應(yīng) ,70nlΠmin 流速的反 應(yīng)產(chǎn)率可達(dá) 90 %。玻璃微珠經(jīng)烷基氨修飾后可與 抗體通過(guò)戊二醛結(jié)合 , Tsukagoshi 等 [24 ] 利用這一方 法在電泳芯片樣品儲(chǔ)液池中固定抗人血清蛋白 ,進(jìn) 行競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)后 ,反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離和化學(xué) 發(fā)光檢測(cè)。測(cè)得人血清白蛋白(HSA) 含量為319gΠL。 同樣的方法 ,在玻璃珠表面固定羊抗人血清 (anti2 IAP) ,測(cè)得血清中癌癥標(biāo)記物 IAP 含量為 272mgΠL。

Sato 等 [25 ,26 ] 用聚苯乙烯微珠固定干擾素抗體 , 此系統(tǒng)的特點(diǎn)是采用反應(yīng)管道中的壩式結(jié)構(gòu)將微珠 固定(圖 1) 。注入干擾素 (IFN) 進(jìn)行免疫反應(yīng) ,再與 維生素 E 聯(lián)結(jié)的羊抗2重組 IFN 多克隆抗體聯(lián)結(jié) ,用 膠狀金粒標(biāo)記后 ,進(jìn)行產(chǎn)物的熱透鏡檢測(cè)。芯片設(shè) 計(jì)為四通道 ,可以同時(shí)測(cè)定 4 個(gè)樣品 ,4 個(gè)樣品從反 應(yīng)到分析總共需要 50min ,檢測(cè)限達(dá)到0101ngΠml ,而 常規(guī)方法每個(gè)樣品就要 35min。這種方法利用微流 控芯片的高通量及靈活的流體操作來(lái)處理酶聯(lián)免疫 反應(yīng) ,可以大大節(jié)省檢測(cè)時(shí)間及試劑消耗。Kim 等 [27 ]利用結(jié)合了抗體的順磁性納米顆粒與熒光標(biāo) 記聚苯乙烯微珠通過(guò)抗原2抗體作用力發(fā)生吸附 ,在 外界磁場(chǎng)作用下分離 ,進(jìn)行了兔和鼠免疫球蛋白的 測(cè)定。Luo 等 [28 ]將金納米粒子作為抗原蛋白載體沉 積在 PDMS 管壁 ,進(jìn)行了羊抗人 IgG的測(cè)定 ,檢測(cè)靈 敏度達(dá)到 10 ngΠml。

圖 1 非均相酶聯(lián)免疫反應(yīng)芯片[25 ,26 ]

Fig. 1 Microchip of inhomogeneous ELISA[25 ,26 ]

（4）硝化纖維膜固定酶

纖維素結(jié)構(gòu)中存在大量羥基 ,可通過(guò)氧化、酯化、醚化和交聯(lián)等各種反應(yīng)進(jìn)行功能化處理 ,用于酶 或抗體的固定。Park 研究組[29 ] 將市售硝化纖維膜 經(jīng)過(guò)溶解再成型 ,通過(guò)不可逆疏水作用力將β2牛乳 糖與膜吸附固定 ,固定化的酶位于十字型電泳芯片 管道交叉口下游 (圖 2) ,當(dāng)樣品流經(jīng)酶固定床的時(shí) 候與之發(fā)生反應(yīng) ,然后產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離。進(jìn)行了 FDG(fluorescein di2β2D2galactopyranoside) 的β2牛乳糖 降 解 反 應(yīng) 和 FMG ( fluorescein mono2β2D2galact2 opyranoside) 與β2牛乳糖的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究 ,測(cè)得 的 Km = 11217 ,與其他報(bào)道值 117 接近。

圖 2 非均相衍生反應(yīng)電泳芯片結(jié)構(gòu)[29 ]

Fig. 2 Structures of CE2microchip for inhomogeneous reactions[29 ]

（5）原位聚合固定酶

Mersal 等 [30 ] 用硅烷化試劑 (γ2MAPS) 修飾玻璃 芯片微管道 ,在進(jìn)樣管道中通過(guò)原位聚合的方法制 作固定有葡萄糖氧化酶的聚酰胺整體柱 ,作為柱前 反應(yīng)器 ,進(jìn)行了果汁中葡萄糖的酶反應(yīng)及電泳分離、 安培檢測(cè)。這種固定化酶可以連續(xù)使用 8h 而不失 活。Qu 等 [31 ] 報(bào)道了在硅烷化試劑 (XPS) 修飾過(guò)的 PMMA 微管道中通過(guò)原位聚合的方法制作硅膠整體 柱來(lái)固定牛血清白蛋白 ,用作質(zhì)譜檢測(cè)的衍生處理芯片。

（6）其它固定方法

Phillips 等 [32 ,33 ] 用膠囊融合的方法在等離子體 氧化處理過(guò)的 PDMS 管壁上引入卵磷脂雙分子層 膜 ,可以使表面的浸濕性大為改善。將霍亂病毒綁 定在膜上 ,然后與兔抗2霍亂病毒發(fā)生免疫反應(yīng) ,再 聯(lián)結(jié)熒光標(biāo)記的二抗后進(jìn)行熒光檢測(cè)。接觸角測(cè)定 顯示雙分子層膜處理的 PDMS 管壁親水表面可保持 幾小時(shí)。Wells 等 [34 ]提出了一種新的 Y型微管道中 酶的固定方法 : 在壓力驅(qū)動(dòng)的微管道中施加與壓力 梯度相反的電場(chǎng) ,利用這種競(jìng)爭(zhēng)作用力將靶蛋白β2 乳球蛋白捕獲并固定在負(fù)極區(qū)域 ;然后依次注入 DDT(dithiothreitol) 分解二硫鍵 ,碘乙酰胺使巰基丙氨 酸烷烴化 ,胰島素和蛋白質(zhì)降解酶水解 ;多步反應(yīng)后 反接電場(chǎng) ,將產(chǎn)物沖出管道進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè) (圖 3) 。 此外 ,還有報(bào)道利用高聚物管壁與蛋白質(zhì)的非特異 性結(jié)合力固定葡萄糖氧化酶[35 ] ,兩性磷脂聚合物或 多分子層膜固定胰蛋白酶[36 ,37 ] ,動(dòng)態(tài)橡膠微珠固定 地高辛單克隆抗體[38 ] ,以及在 PDMS 聚合物材料里 面添加生物素2磷脂 ,用于固定鏈霉素[39 ] 。

圖 3 電場(chǎng)固定化酶反應(yīng)微流控芯片[34 ]

 Fig. 3 Enzyme solidification by electric field on microchip[34 ]

2.微流控芯片上均相酶和免疫反應(yīng)

非均相酶和免疫反應(yīng)雖然可以提高酶和抗體的 利用率 ,但是芯片上蛋白質(zhì)的固定化難度較大 ,而且 固定化都會(huì)一定程度上改變酶或抗體的分子結(jié)構(gòu) , 影響其反應(yīng)活性 ;而均相反應(yīng)會(huì)大大提高分子的傳 質(zhì)能力 ,縮短生化反應(yīng)的時(shí)間且沒(méi)有復(fù)雜的蛋白質(zhì) 固定化程序。微流控芯片超微量的樣品消耗以及靈 活的流體操作也更適合于均相反應(yīng)。因此 ,微流控 芯片上更適合于集成各種類型的均相生化反應(yīng)過(guò) 程 ,其研究的重點(diǎn)在于如何通過(guò)合理微管道構(gòu)型設(shè) 計(jì)進(jìn)行反應(yīng)液流的操縱。也有報(bào)道采用多相流或微 液滴技術(shù)進(jìn)行酶反應(yīng)[40 ,41 ] ,其液流控制技術(shù)難度較 大 ,目前來(lái)看 ,用于實(shí)際的樣品分析尚需一定的時(shí) 間 ,本文對(duì)這部分內(nèi)容不做詳細(xì)介紹。

（1）微管道柱前反應(yīng)

直接在離線的微反應(yīng)管中進(jìn)行酶或免疫反應(yīng) , 然后將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到電泳芯片上進(jìn)行電泳分離和 檢測(cè)是芯片上生化反應(yīng)集成的最初設(shè)想。TNT和單 · 228 · 化 　學(xué) 　進(jìn) 　展 第 19 卷 克隆 TNT抗體及熒光素標(biāo)記三硝基苯的競(jìng)爭(zhēng)免疫 反應(yīng)產(chǎn)物[42 ] ,以及重組破傷風(fēng)毒素 C 片段(CTTC) 與 單克隆破傷風(fēng)病毒 C 片段抗體 (anti2TTC) 及熒光標(biāo) 記的牛血清白蛋白競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)產(chǎn)物[43 ] 已經(jīng)被成 功轉(zhuǎn)移到電泳芯片上進(jìn)行分離和檢測(cè)。Caliper 公司 的Lin 等 [44 ]設(shè)計(jì)的芯片(圖 4) 用來(lái)進(jìn)行熒光標(biāo)記底 物與磷酸脂酶的反應(yīng) (在孔板上進(jìn)行) ,然后進(jìn)行 MEKC分離 ,測(cè)定酶的活性 ,通過(guò)抑制劑滴定進(jìn)行高 通量篩選。這種方法實(shí)際上并沒(méi)有真正地將生化反 應(yīng)集成到微流控芯片上 ,只是利用了電泳芯片的分 離功能 ;而且在反應(yīng)產(chǎn)物由反應(yīng)器轉(zhuǎn)移至電泳芯片 的過(guò)程中勢(shì)必造成試劑的損耗 ,這個(gè)不連續(xù)的過(guò)程 可能對(duì)最終的分析造成誤差。

圖 4 多通道電泳芯片[44 ]

Fig. 4 Multi2channel CE2microchip[44 ]

直接在電泳芯片樣品貯液池中進(jìn)行的酶和免疫 反應(yīng)一定程度上避免了這個(gè)問(wèn)題。利用這一設(shè)計(jì)方 法 ,Starkey 等 [45 ]在電泳芯片的樣品儲(chǔ)液池中進(jìn)行β2 葡糖甘酸酶與熒光標(biāo)記的單2β2D2葡萄糖甘酸反應(yīng) , 然后經(jīng)電泳分離和熒光檢測(cè) ,進(jìn)行酶的抑制分析。 Abad2Villar 等 [46 ]結(jié)合非接觸式電導(dǎo)檢測(cè)進(jìn)行了人免 疫球蛋白 IgM 的直接免疫分析。Wang 等 [47 ] 使用普 通的十字型電泳芯片 ,在樣品貯液池進(jìn)行對(duì)氧磷、對(duì) 硫磷和甲基對(duì)硫磷的有機(jī)磷水解、酶降解反應(yīng)生成 電化學(xué)活性的硝基酚磷酸酯 ,反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳分離 和電導(dǎo)檢測(cè)。他們還將葡萄糖氧化酶加入到緩沖液 中 [48 ] ,在分離管道中酶與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)生成葡萄 糖酸和 H2O2 ,實(shí)現(xiàn)了葡萄糖、尿酸、維生素 C 和對(duì)乙 酰氨基酚的同步檢測(cè)。Schwarz[49 ] 在電泳運(yùn)行緩沖 液中添加葡萄糖氧化酶 ,催化有機(jī)胺的循環(huán)氧化 ,增 強(qiáng)安培檢測(cè)信號(hào)。這些在貯液池或分離管道中進(jìn)行 的生化反應(yīng)和后續(xù)的檢測(cè)雖然是連續(xù)的 ,但這些反 應(yīng)器都是非流動(dòng)式的 ,沒(méi)有任何流體的擾動(dòng) ,反應(yīng)程 度也是不可控制的 ,反應(yīng)物僅通過(guò)簡(jiǎn)單的分子擴(kuò)散 混合 ,傳質(zhì)較慢 ,需要反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)。但對(duì)某些酶和 免疫快反應(yīng) ,由于可以簡(jiǎn)化芯片設(shè)計(jì) ,這種反應(yīng)方法 也經(jīng)常被人們采用。

設(shè)計(jì)柱端反應(yīng)器是電泳芯片上酶和免疫反應(yīng)最 常用也是最有效的手段。因?yàn)槲⒘骺匦酒响`活多 變的流路設(shè)計(jì)使得生化反應(yīng)可控性更強(qiáng) ,從反應(yīng)尤 其是多步反應(yīng)到分離檢測(cè)一系列連續(xù)操作過(guò)程 ,大 大節(jié)省了分析時(shí)間 ,微尺寸的反應(yīng)管道可節(jié)省昂貴 的生化試劑。因此 ,這一領(lǐng)域的研究相當(dāng)活躍。柱 端反應(yīng)管道設(shè)計(jì)的出發(fā)點(diǎn)是通過(guò)優(yōu)化混合反應(yīng)管道 的構(gòu)型和尺寸使反應(yīng)物充分混合 ,靈活的液流操作 保證反應(yīng)程度的可控性以及多通道集成進(jìn)行平行檢 測(cè) ,避免多次操作帶來(lái)的偏差。

目前 ,芯片上柱前均相酶和免疫反應(yīng)管道總體 上分為敞開(kāi)式[50 ,51 ]和封閉式[52 ,53 ]兩種。所謂敞開(kāi)式 柱前反應(yīng)器就是酶或免疫反應(yīng)在芯片上的樣品貯液 池中進(jìn)行。但與上述非流動(dòng)式反應(yīng)器不同 ,各種反 應(yīng)試劑是通過(guò)與樣品池相連的試劑貯液池分別引入 的。這種反應(yīng)器中分子的傳質(zhì)較慢 ,需要較長(zhǎng)的停 留反應(yīng)時(shí)間 ,而且敞開(kāi)的反應(yīng)器會(huì)造成試劑的揮發(fā)。 報(bào)道最多的是封閉式的反應(yīng)管道。理論上 ,微混合 器的原理都適用于柱前反應(yīng)器 ,但過(guò)于復(fù)雜的柱前 反應(yīng)操作不利于后續(xù)的分離分析 ,因此柱前反應(yīng)器 多采用簡(jiǎn)單的被動(dòng)混合原理。“T”和“Y”型兩種混 合管道結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、制作難度小 ,是目前微流控分析芯 片上應(yīng)用最為廣泛的反應(yīng)管道構(gòu)型[54 ] 。兩液流完 全依靠分子擴(kuò)散來(lái)實(shí)現(xiàn)混合 ,混合速度取決于混合 管道的寬度和分子的擴(kuò)散系數(shù)。混合器所能達(dá)到的 混合效率取決于微管道的長(zhǎng)度 , 但大多設(shè)計(jì)沒(méi)有進(jìn) 行優(yōu)化 ,其混合效率也就難以保證。Wang 等 [52 ] 對(duì) 柱前“T”型酶反應(yīng)管道(圖 521) 尺寸進(jìn)行了優(yōu)化 ,反 應(yīng)池寬度(200μm) 為進(jìn)樣管道寬度的 4 倍 ,這樣可以 減小反應(yīng)液流的電滲流 ,使反應(yīng)更充分。使用這種 反應(yīng)管道進(jìn)行了葡萄糖、V 型神經(jīng)遞質(zhì)[55 ] 及氨基酸 的柱前反應(yīng)及分離檢測(cè)[56 ] 。有限長(zhǎng)度的直混合管 道的混合能力畢竟是有限的 ,而折疊彎管既可以延 長(zhǎng)混合管道長(zhǎng)度 ,又能在彎管處形成二次流擾動(dòng)混 合液流[57 ] ,增強(qiáng)混合。Cheng 等 [58 ] 的柱前免疫反應(yīng) 器(圖 522) 和 Cohen 等 [54 ]的柱前酶反應(yīng)器(圖 523) 利 用了這一原理 ,在“Y”型混合管道中增加了“U”型折 疊彎管來(lái)增強(qiáng)反應(yīng)液流的傳質(zhì)能力。De Boer 等 [59 ]利用同樣的原理設(shè)計(jì)了集成有反相色譜分離的組織 蛋白酶 B 的微流控酶反應(yīng)器 ,用于生物活性物質(zhì)的 篩選。Belder 等 [60 ]設(shè)計(jì)的柱前酶催化反應(yīng)管道引入 了多個(gè)方型彎管來(lái)增強(qiáng)混合。

圖 5 集成有 T型和 Y型柱前反應(yīng)器的電泳芯片[52 ,54 ,58 ]

Fig. 5 CE2microchips with T or Y pre2column reactors[52 ,54 ,58 ]

我們通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算發(fā)現(xiàn) ,引入 3 個(gè)“U” 型折疊彎管的混合管道的混合效率比等長(zhǎng)的“Y”型 直混合管道高 20 %。十字型混合管道可以同時(shí)注 入 3 種反應(yīng)物液流形成夾流混合 ,進(jìn)行反應(yīng) ,適合于 酶的抑制分析和競(jìng)爭(zhēng)免疫分析。Roper 等 [5 ] 采用十 字型柱前反應(yīng)管道(圖 621) 將胰島素和 FITC 標(biāo)記的 胰島素與抗胰島素抗體同時(shí)引入反應(yīng)管道進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng) 免疫反應(yīng)分析。Hadd 等 [61 ] 用 T 型混合器作為酶底 物的稀釋管道 ,在稀釋管道下游設(shè)計(jì)了十字型管道 用于酶、底物和酶抑制劑的混合反應(yīng)(圖 622) 。

圖 6 集成有十字型柱前反應(yīng)器的電泳芯片[5 ,61 ]

Fig. 6 CE2microchip with cross shaped pre2column reactor[5 ,61 ]

多級(jí)層流混合器有著很高的混合能力 ,雖然目 前還沒(méi)有將其用作酶或免疫反應(yīng)器的報(bào)道 ,但已被 用作生物胺的芯片電泳柱前熒光標(biāo)記反應(yīng)管道[7 ] (圖 7) 。我們研究組通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬發(fā)現(xiàn) ,對(duì)混合 液流進(jìn)行 4 次拆分的多級(jí)層流混合器 ,羅丹名 6G在 6mm 的混合距離內(nèi)可以達(dá)到 99 %的混合效率 ,遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于其它構(gòu)型的被動(dòng)混合器。

圖 7 集成有多級(jí)層流柱前反應(yīng)器的電泳芯片[7 ]

Fig. 7 CE2microchip with multi2channel pre2column reactor[7 ]

柱前均相反應(yīng)需要靈活精確的液流控制來(lái)保證 反應(yīng)和分離檢測(cè)的同時(shí)進(jìn)行以及準(zhǔn)確的進(jìn)樣。在壓 力驅(qū)動(dòng)的芯片裝置上 , Kerby 等 [62 ] 根據(jù)流體力學(xué)計(jì) 算設(shè)計(jì)網(wǎng)絡(luò)管道 ,利用管道寬度的不同(10 —100μm) 來(lái)控制流體阻力 ,進(jìn)行反應(yīng)液流控制。在電驅(qū)動(dòng)微 流控芯片裝置上 ,根據(jù)電流和試劑流量的定量關(guān)系 , 通過(guò)調(diào)節(jié)電流的大小和方向來(lái)控制反應(yīng)試劑的稀釋 濃度以及液流的流向是較為常用的方法[54 ,61 ,63 ] ,也 是比較容易實(shí)現(xiàn)的。為了使柱前反應(yīng)和分離檢測(cè)同 時(shí)進(jìn)行 ,反應(yīng)管道和分離管道需要設(shè)計(jì)成獨(dú)立的流 路 [54 ] 。Roper 等 [5 ]設(shè)計(jì)了單個(gè)電源控制的免疫電泳 芯片 ,用來(lái)檢測(cè)由胰島分泌的胰島素。反應(yīng)管道和 · 428 · 化 　學(xué) 　進(jìn) 　展 第 19 卷 分離管道采用并聯(lián)式設(shè)計(jì) ,使用同一個(gè)廢液池(圖 62 1) ,反應(yīng)和分離過(guò)程同時(shí)進(jìn)行 ,15s 內(nèi)可完成整個(gè)分 析過(guò)程。對(duì)于有些較慢且需要加熱的酶反應(yīng) ,要使 反應(yīng)充分進(jìn)行 ,可以采用溶液停留技術(shù)使反應(yīng)物在 加熱區(qū)域滯留 ,控制反應(yīng)時(shí)間使之反應(yīng)完全[64 ,65 ] 。 門式進(jìn)樣是集成有柱前反應(yīng)器電泳芯片系統(tǒng)最理想 的進(jìn)樣方法 ,這種進(jìn)樣技術(shù)可以滿足反應(yīng)和進(jìn)樣的 快速切換。

微流控分析芯片多次操作重復(fù)性較差一直困擾 著眾多研究者 ,尤其是集成了柱前反應(yīng)之后 ,復(fù)雜的 流體操作更難以保證分析結(jié)果的重現(xiàn)性 ,這對(duì)于需 要多次平行測(cè)定的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)滴定分析及競(jìng)爭(zhēng)免 疫分析是極為不利的。集成多通道的微流控分析芯 片單次操作就可以完成一系列的滴定操作 ,彌補(bǔ)了 這一缺陷。Cheng 等 [58 ]設(shè)計(jì)了六通道的集成免疫反 應(yīng)電泳芯片(圖 522) ,用來(lái)進(jìn)行卵清蛋白(ovalbumin) 和抗卵清蛋白的免疫反應(yīng)和熒光掃描檢測(cè)。Kang 等 [51 ]將高通量的微流控混合反應(yīng)器與孔板中熒光 顯影檢測(cè)相結(jié)合 ,利用壓力驅(qū)動(dòng)的濃度梯度混合器 使酶底物形成一系列濃度 ,同時(shí)平行注入下游孔板 中 ,與從相反方向注入的堿性磷酸酶在孔板中反應(yīng) , 然后通過(guò)孔板熒光顯影進(jìn)行檢測(cè) ,一次操作就可以 完成酶的滴定(圖 8) 。這種方法巧妙地結(jié)合了微流 圖 8 酶活性滴定分析微流控芯片[51 ] Fig. 8 Microchip used for enzyme activity titration[51 ] 控芯片靈活的流體處理能力和生物芯片的高通量平 行檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。Duffy 等 [66 ]設(shè)計(jì)了 48 通道的圓盤式 芯片系統(tǒng) ,在離心力驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行茶堿的酶抑制動(dòng)力 學(xué)研究 ,一次操作就可以完成 3 次平行滴定 (15 個(gè)系列濃度) ,總的分析時(shí)間為 3min。多通道集成的 酶抑制分析和競(jìng)爭(zhēng)免疫分析微流控芯片裝置 ,很大 程度上降低了常規(guī)實(shí)驗(yàn)室操作以及單通道微流控操 作多次測(cè)量引入的偏差 ,大大縮短了分析時(shí)間。但 是也必須看到 ,有限面積的芯片上集成了大量的樣 品池 ,手工加樣操作較煩瑣 ,而且很容易造成試劑污 染 ,這也是集成芯片系統(tǒng)需要解決的問(wèn)題之一。

圖 8 酶活性滴定分析微流控芯片[51 ]

Fig. 8 Microchip used for enzyme activity titration[51 ]

（2）微管道柱后反應(yīng)

柱后反應(yīng)會(huì)直接導(dǎo)致樣品分離譜帶的展寬 ,影 響電泳分離的柱效。但是有些反應(yīng) ,如蛋白質(zhì)的熒 光標(biāo)記[65 ] 、化學(xué)發(fā)光衍生反應(yīng)[67 —69 ] ,有時(shí)不得不采 用柱后衍生。Liu 等 [70 ]在電泳芯片上設(shè)計(jì)了柱后化 學(xué)發(fā)光衍生管道 ,采用螢火蟲(chóng)熒光素Π熒光素酶生物 發(fā)光體系 ,對(duì)大腸桿菌細(xì)胞萃取液進(jìn)行了 ATP 及 ATP 代謝物的檢測(cè)(圖 9) 。蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記反應(yīng) 一般發(fā)生在氨基或其它活性基團(tuán)上 ,蛋白質(zhì)分子中 多個(gè)反應(yīng)點(diǎn)的存在 ,可衍生出多種電泳淌度不同的 物質(zhì) ,而且熒光染料與氨基的吸附使得蛋白質(zhì)分子 淌度差減小 ,更難以進(jìn)行電泳分離 ,因此蛋白標(biāo)記多 采用柱后衍生[71 ] 。

圖 9 集成有柱后反應(yīng)器的電泳芯片[70 ]

Fig. 9 CE2microchip with post2column reactor[70 ]

同時(shí)集成有柱前和柱后反應(yīng)器的電泳芯片 (圖 1021) [64 ] ,對(duì)管道設(shè)計(jì)和電壓的施加方式都有很高的 要求。首先流路的設(shè)計(jì)必須保證反應(yīng)和分離過(guò)程不 相互沖突 ,各種試劑不交叉污染 ,緩沖液的 pH 值不 影響酶或抗體的活性以及能夠通過(guò)控制電壓來(lái)控制 各種試劑的流量。最重要的問(wèn)題是如何通過(guò)優(yōu)化管 道的設(shè)計(jì) ,使柱前和柱后反應(yīng)不至引入太大的柱效 損失。

Wang 等 [3 ]在電泳芯片上集成柱前反應(yīng)器進(jìn)行 酶標(biāo)記抗體(抗人胰島素) 和抗原(胰島素) 的免疫反 應(yīng)及葡萄糖脫氫酶 ( GDH) 和葡萄糖在輔酶 (NAD+ ) 存在下的酶反應(yīng) ,電泳分離后在柱后反應(yīng)管道中進(jìn) 行堿性磷酸酶和其底物 ( p2nitrophenyl phosphate ( p2 NPP) ) 的衍生反應(yīng) ,安培檢測(cè) NADH 和 p2NP 產(chǎn)物 (圖 1022) 。用同樣的裝置 ,在柱前反應(yīng)器進(jìn)行磷酸 酯酶標(biāo)記抗體(anti2mouse IgG) 和抗原 (mouse IgG) 的 免疫反應(yīng) ,然后電泳分離免疫復(fù)合物和未反應(yīng)的抗 第 5 期 徐 　溢等 　微流控分析芯片上生化反應(yīng)技術(shù)研究進(jìn)展 · 528 · 體 ,在柱后進(jìn)行酶示蹤物質(zhì)與 42aminophenyl (PAPP) 磷酸底物衍生化反應(yīng) ,生成電化學(xué)活性的 42氨基酚 (PAP) 進(jìn)行安培檢測(cè)。分析表明抗體和抗原的電遷 移率相差較大 , 柱前柱后反應(yīng)導(dǎo)致明顯的譜帶 展寬[72 ] 。

圖 10 同時(shí)集成柱前和柱后反應(yīng)管道的電泳芯片[3 ,64 ]

Fig. 10 Electrophoresis microchips integrated both pre2and post2column reaction channels[3 ,64 ]

目前關(guān)于混合管道的研究已經(jīng)相當(dāng)深入 ,人們 提出了各種用來(lái)提高混合器混合效率的方法[73 —75 ] 。但是可以看出 ,真正用于微流控分析芯片上混合反 應(yīng)的設(shè)計(jì)只有被動(dòng)混合器 ,而且也只是最簡(jiǎn)單的T型或Y型管道結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)的混合反應(yīng)管道 ,其 混合效率實(shí)際上是有限的。微流控分析芯片最終的 目的是分析 ,復(fù)雜的反應(yīng)處理會(huì)影響測(cè)定的重復(fù)性 , 降低分離柱效。如何權(quán)衡這兩者的關(guān)系將是微流控 芯片研究者需要解決的問(wèn)題。

微流控芯片上酶聯(lián)免疫反應(yīng)

酶聯(lián)免疫分析(ELISA) 最常見(jiàn)的是在 96 孔板上 進(jìn)行。常規(guī)的 ELISA 由于其單調(diào)費(fèi)時(shí)的處理過(guò)程 , 經(jīng)常導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。分析過(guò)程中需要一系列的混 合和清洗過(guò)程 ,由于每一步都要較長(zhǎng)的溫育時(shí)間 ,一 次分析經(jīng)常需要兩天的時(shí)間 ,這個(gè)時(shí)間是由于抗體Π 抗原較低的傳質(zhì)效率造成的 ,而免疫反應(yīng)本是快反 應(yīng)。微流控芯片高通量和流體驅(qū)動(dòng)方便的特點(diǎn)已使 越來(lái)越多的研究者嘗試著將 ELISA 轉(zhuǎn)移到微流控芯 片上來(lái)進(jìn)行[76 —78 ] 。Lai 等 [79 ] 設(shè)計(jì)了圓盤形離心力驅(qū) 動(dòng)的 96 通道 ELISA 分析微流控裝置(圖 1121) ,用來(lái) 進(jìn)行鼠雜種瘤培養(yǎng)細(xì)胞中鼠 IgG抗體分析。每個(gè)通 道上有 11 個(gè)貯液池用來(lái)引入反應(yīng)物和洗脫液 ,在每 個(gè)貯液池下方設(shè)計(jì)毛細(xì)管閥進(jìn)行液流控制 ,精確的 管道幾何設(shè)計(jì)使單個(gè)儲(chǔ)液池中的溶液充滿檢測(cè)池而 不泄露到其它液池。通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速 ,離心力和毛細(xì)作用力相互競(jìng)爭(zhēng)分別完成每一步反應(yīng)和相應(yīng)的清洗 過(guò)程[79 ] 。每步反應(yīng)試劑消耗為 1μl ,整個(gè)分析時(shí)間 降到了 30min。

圖 11 酶聯(lián)免疫(ELISA) 衍生反應(yīng)微流控裝置[79 ,80 ]

Fig. 11 Microfluidic devices of ELISA derivatization[79 ,80 ]

肉毒菌神經(jīng)毒素是毒性最大的底物 ,人的致死 量為 1ngΠkg。使用常規(guī)治療方法需要 4 天的時(shí)間 , 而目前肉毒菌中毒最有效的治療方法就是中毒后盡 快處理毒素 ,但必須在毒素和神經(jīng)結(jié)合之前(24h) 進(jìn) 行。芯片上的檢測(cè)可大大縮短檢測(cè)時(shí)間。Moorthy 等 [80 ]用他們?cè)O(shè)計(jì)的 ELISA 微流控裝置 (圖 1122) 直 接檢測(cè)全血樣品中的肉毒菌神經(jīng)毒素。該裝置集成 了混合器、水凝膠濾膜以及閥門 ,實(shí)現(xiàn)了過(guò)濾、混合、 溫育和樣品預(yù)處理過(guò)程。為了檢測(cè)類毒素 ,在鏈鎖 球菌處理的瓊脂糖膠微珠上固定維生素 H 抗體 ,第 二抗體上的磷酸酯酶與酶底物反應(yīng)生成不溶的有色 · 828 · 化 　學(xué) 　進(jìn) 　展 第 19 卷 沉淀包覆在微珠上 ,使裸露的染料便于檢測(cè)。使用 這個(gè)裝置可以檢測(cè)到全血中臨床相關(guān)量的毒素。

微流控芯片上含氮氧化物檢測(cè)的反應(yīng)

含氮氧化物在生理學(xué)上是很重要的信號(hào)化合 物 ,包括神經(jīng)傳遞、血管舒張和發(fā)炎等癥狀。含氮氧 化物可轉(zhuǎn)化成硝酸鹽和亞硝酸鹽混合物 ,最常用的 檢測(cè)方法是 Griess 反應(yīng)。Hanajiri 等 [81 ] 在電泳芯片 樣品池中放置銅包覆的鎘顆粒將樣品中的硝酸鹽轉(zhuǎn) 化成亞硝酸鹽 ,用間接安培檢測(cè)法檢測(cè)含氮氧化物 釋放劑 (32morpholinosydnonimine) 釋放出的硝酸鹽和 亞硝酸鹽。Goto 等 [82 ] 使用鼠腹膜巨噬細(xì)胞為模型 , 在玻璃芯片上集成了細(xì)胞培養(yǎng)、Griess 反應(yīng)、酶反 應(yīng)、溫度控制以及熱透鏡檢測(cè) ,實(shí)現(xiàn)了脂多糖刺激細(xì) 胞釋放氮氧化物的檢測(cè)。與常規(guī)的檢測(cè)方法相比 , 其總的分析時(shí)間由 24h 減少到 4h ,檢測(cè)限由 10 - 6 molΠL 降到 7 ×10 - 8 molΠL。

微流控芯片上的 PCR反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)已成為核酸分析的主要方法 ,被 廣泛用于 DNA 序列擴(kuò)增反應(yīng)、臨床診斷和人類基因 測(cè)序等。目前 PCR 微流控芯片主要集中于反應(yīng)功 能芯片的研究。PCR 裝置不但要求巧妙的流路設(shè) 計(jì) ,還需要集成加熱器和溫度傳感裝置[83 ] ,因此 PCR 芯片只用作反應(yīng)功能芯片[84 —86 ] 。Ivonne 等 [8 ] 對(duì) PCR 反應(yīng)功能芯片做了詳細(xì)的綜述。擴(kuò)增產(chǎn)物最終 要進(jìn)行分析檢測(cè) ,產(chǎn)物與電泳分離檢測(cè)以及其它檢 測(cè)方式接口的研究是非常重要的。本文只討論與芯 片電泳聯(lián)用的集成 PCR 反應(yīng)器。

集成在電泳芯片上的 PCR 反應(yīng)器與 PCR 反應(yīng) 功能芯片不同 ,因?yàn)樗仨毤骖欕娪痉蛛x過(guò)程 ,而電 泳分離過(guò)程在溫度要求上剛好與需要循環(huán)加熱的 PCR 反應(yīng)相反 ,要達(dá)到較高的分離柱效 ,分離管道系 統(tǒng)的溫度應(yīng)盡可能低。這就要求 PCR 反應(yīng)器僅在 反應(yīng)區(qū)域局部加熱 ,而且要有良好的散熱功能。最 簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)是直接在樣品池中進(jìn)行 PCR 反應(yīng) ,將整 個(gè)芯片放在常規(guī)循環(huán)加熱器上進(jìn)行加熱和控 溫 [87 ,88 ] 。利用這種加熱方法 Dunn 等設(shè)計(jì)了用來(lái)測(cè) 定老鼠基因多態(tài)現(xiàn)象的 PCR 電泳芯片 (圖 1222) 。 這種設(shè)計(jì)實(shí)際上并沒(méi)有將 PCR 反應(yīng)集成到電泳芯 片上 ,從反應(yīng)到分離過(guò)程的操作也是不連續(xù)的。 Hataoka 等 [89 ]使用標(biāo)準(zhǔn) DNA 芯片 ,在片上加工了鋁 片加熱器 ,進(jìn)行前列腺特征抗體碎片的擴(kuò)增及電泳 分析。珀耳帖(Peltier) 是很成熟的一種微電子元件 ,可直接貼在 PCR 反應(yīng)管道上很方便地實(shí)現(xiàn)局部溫 度控制。Wook 等 [90 ]制作的 T 型 PCR 柱前反應(yīng)器使 用了這種加熱元件 ,熱電偶帖在片上用作溫度傳感 , 進(jìn)行 λDNA 擴(kuò)增及產(chǎn)物的凝膠電泳分離檢測(cè)。 Lagally 等 [91 ]在 PCR 電泳芯片上通過(guò)電沉積加工金 加熱器和 Pt 溫度傳感器 ,進(jìn)行病原體和大腸桿菌的 基因擴(kuò)增和電泳分離檢測(cè)(圖 1221) 。這種制作方法 才是真正意義上的 PCR 電泳芯片 ,因?yàn)樗耆珡碾?泳芯片的整體結(jié)構(gòu)出發(fā) ,設(shè)計(jì)并制作 PCR 柱前反應(yīng) 器 [92 ] 。

圖 12 PCR 產(chǎn)物檢測(cè)電泳芯片[88 ,91 ]

Fig. 12 Electrophoresis microchip for PCR products detection[88 ,91 ]

PCR 反應(yīng)需要較長(zhǎng)時(shí)間 ,反應(yīng)過(guò)程中必須保證 反應(yīng)物保持在反應(yīng)室而不流到其它管道 ,而且擴(kuò)增 產(chǎn)物一般需要進(jìn)行凝膠電泳分離 ,在分離管道充入 凝膠的過(guò)程中還必須保證其不進(jìn)入 PCR 反應(yīng)室。 這就要求在反應(yīng)室和分離管道之間設(shè)計(jì)閥門。緊縮 管道是較為常用的停止閥[87 ,90 ] ,即在反應(yīng)管道過(guò)渡 到分離管道的區(qū)域設(shè)計(jì)一段寬度很小的過(guò)渡管道 , 窄管道的流體阻力可起到閥的作用。Lagally 等 [91 ] 制作了 PDMS 膜閥來(lái)控制樣品的位置 ,對(duì)進(jìn)樣管道 和 PCR 反應(yīng)池的幾何構(gòu)型進(jìn)行了優(yōu)化 ,準(zhǔn)確控制篩 分介質(zhì)進(jìn)入分離管道。

結(jié)論與展望

綜上所述 ,越來(lái)越多的生物化學(xué)反應(yīng)被集成到 微流控芯片上。酶和免疫反應(yīng)的高特異性、PCR 反 應(yīng)的信號(hào)增強(qiáng) ,以及其它反應(yīng)的靈活性與微流控裝 置的高通量、低試劑消耗、靈活的流路設(shè)計(jì)和高集成 能力相結(jié)合 ,一改傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室生化分析和臨床診斷 第 5 期 徐 　溢等 　微流控分析芯片上生化反應(yīng)技術(shù)研究進(jìn)展 · 928 · 所存在的操作過(guò)程不連續(xù)、廢時(shí)和成本高等缺點(diǎn)。 但也必須看到 ,生化反應(yīng)在微流控分析芯片上的集 成還處在快速發(fā)展階段 ,尚不成熟。芯片操作的重 復(fù)性較差 ,芯片上生化反應(yīng)的可控性不強(qiáng) ,集成能力 還不夠高是微流控芯片發(fā)展亟待解決的問(wèn)題。可以 肯定的是 ,集成有生化反應(yīng)的微流控分析芯片正在 朝著臨床診斷、藥物篩選、核酸分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng) 域快速發(fā)展 ,并顯示出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力。

文獻(xiàn)來(lái)源：中圖分類號(hào) : O652 ; R39211 ; Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 : A 文章編號(hào) : 10052281X(2007) 0520820212 作者：徐溢，呂君江，范偉，溫志渝

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