文章來源：周子琦, 李舒婷, 田杰生, 賀萬崇, 許文濤. 趨磁細菌改造及磁小體功能化的研究進展. 生物技術(shù)通報, 2019, 35(4): 139-150

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摘要：趨磁細菌(Magnetotactic bacteria，MTB)是一種可在外磁場作用下沿磁場線定向運動的革蘭氏陰性菌，其體內(nèi)的磁小體(Bacterial magnetosomes，BMs)是由MTB經(jīng)過生物礦化合成的。BMs在MTB體內(nèi)成鏈狀排列，由外層膜和內(nèi)部磁鐵礦晶體構(gòu)成。BMs具有大小均一，單磁疇，大的比表面積，良好的生物相容性，超順磁性等特點被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域。目前，基于MTB的改造方法相對較少且主要偏向于通過改變BMs的形態(tài)、組成等進一步達到改造MTB的目的。BMs的功能化策略相對較多，主要分為化學(xué)修飾和生物修飾兩種。綜述了MTB和BMs的基本特性及篩選技術(shù)，并著重介紹了MTB的改造方法和BMs的功能化策略，最后討論了MTB改造和BMs功能化在實際應(yīng)用中的意義以及存在的問題。展望了MTB改造和BMs功能化的發(fā)展前景，可能面臨的機遇及挑戰(zhàn)，以期能夠進一步促進MTB和BMs在實際中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：趨磁細菌,改造,磁小體,功能化

趨磁細菌(Magnetotactic bacteria，MTB)是一種依靠體內(nèi)生物礦化所產(chǎn)生的磁性納米顆粒，能夠在外磁場的作用下定向運動的革蘭氏陰性菌[1-2]，一般為微好氧或厭氧型。其內(nèi)部的磁性納米顆粒為磁小體(Bacterial magnetosomes，BMs)，在MTB體內(nèi)組裝成長鏈狀，沿菌體長軸排列，在外磁場中引導(dǎo)菌體的運動。目前，MTB主要存在于細菌域的五大譜系內(nèi)，其中3個屬于變形桿菌門，分別是α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)和δ-變形桿菌綱(Deltaproteobacteria)，剩下兩個分別屬于Latescibacteria門和Omnitrophica門[3]。此外還有未被培養(yǎng)的MTB屬于硝化螺旋菌門[4]。2017年，Liu[5]等在海底馬里亞納火山沉積物中發(fā)現(xiàn)了16種新型MTB，證實了MTB的種類多樣性與其在進化中的生物礦化密不可分。

BMs主要由外層脂質(zhì)膜和內(nèi)部磁鐵礦晶體構(gòu)成，BMs的外膜由MTB細胞膜內(nèi)陷生成。磁鐵礦晶體形態(tài)多樣，大小均一，為單磁疇納米顆粒，具有較好的生物相容性、磁控性、磁熱性、超順磁性和較低的毒性。

目前有關(guān)MTB的改造工作主要基于改變菌體內(nèi)BMs的形態(tài)、組成等達到間接改造MTB的目的，且主要通過化學(xué)修飾和物理修飾這兩種策略對BMs進行功能化，進而在BMs表面修飾抗體、核酸、藥物等多種物質(zhì)應(yīng)用于生物傳感和癌癥治療等多個領(lǐng)域。當(dāng)前用于BMs磁性檢測的手段主要有Schüler等[6]的Camg法和在Camg法基礎(chǔ)上改進的Ramg法[7]。在生物傳感方面，與人工合成的磁性納米粒子相比，BMs的應(yīng)用主要局限于在膜的表面修飾上抗體，利用抗原抗體特異性免疫反應(yīng)來實現(xiàn)目標物質(zhì)的檢測，形式比較單一。

1 趨磁細菌的基本特性及特點

1.1 趨磁細菌的結(jié)構(gòu)組成及基本特性

MTB通常是微好氧或者厭氧型的革蘭氏陰性菌，具有叢生、一端或兩端生的鞭毛[5]，可以在外磁場的作用下沿磁感線方向運動。目前研究發(fā)現(xiàn)的MTB的種類與其所處環(huán)境有一定關(guān)系，主要有桿菌、球菌、螺旋菌、弧菌和卵菌等[8]，分布在海洋、淡水等水體的沉積物中，豐度高低與沉積物的顆粒大小正相關(guān)[9]。不同類型的MTB所產(chǎn)生的磁性納米顆粒，即BMs的形態(tài)也各不相同，因此不同種類MTB所具有的磁性也有很大差異。此外，其活菌具有一定的高熱適應(yīng)性(活菌可作為研究生物非熱噪音的一種工具)[10]。

MTB產(chǎn)生BMs的過程稱為生物礦化(圖 1)，雖然其具體機制尚未得到細致的解答[11]，但可分為以下幾個重要階段:(1)細胞膜內(nèi)陷形成磁小體膜；(2)磁小體鏈的組裝；(3)環(huán)境中游離的鐵離子通過細胞膜上的多種跨膜蛋白協(xié)助進入磁小體膜內(nèi)[12]；(4)空腔中的鐵離子聚集；(5)鐵離子形成磁鐵礦晶體。MTB內(nèi)部數(shù)量不等的BMs呈長鏈狀，沿著細菌體內(nèi)的肌動蛋白絲排列[13]，沿長軸分布。MTB根據(jù)鏈狀BMs提供的磁偶極矩沿著地磁場線運動，尋找適宜生存的低氧濃度區(qū)域得以存活，將三維空間中的運動轉(zhuǎn)變?yōu)檠刂卮艌鼍€的一維運動，便于尋找適宜的生存區(qū)域[13]，因此其生存區(qū)域常位于有氧無氧界面，即水與污泥交界面上[5]。在海洋河流等流動性的生存環(huán)境中，磁場可使得具有磁性的MTB克服水中的逆流并進行長距離的運動[14]。由于地理南北極和地磁場南北兩極的劃分，MTB的運動方向通常有所不同:一般認為在北半球分離得到的MTB會沿著地磁線向地磁南極游動，而在南半球分離得到的MTB會向地磁北極游動，處在赤道的MTB具有兩極趨向性。

圖 1 磁小體形成過程[15]

1.2 趨磁細菌的分離與篩選技術(shù)

MTB本身以及其產(chǎn)生的BMs具有很高的應(yīng)用價值，在各領(lǐng)域的需求量逐漸增多，但是細菌對于環(huán)境和營養(yǎng)的要求高、生長速率緩慢、遺傳復(fù)雜性高，人工大量培養(yǎng)困難。并且由于缺乏對于MTB的篩選，品質(zhì)優(yōu)良且大量的BMs更難得到。因此人們需要提高MTB富集、收集和篩選的技術(shù)。首先需要采集泥樣，根據(jù)MTB的生境，一般是在水與污泥交界面取水泥樣品再進行富集。當(dāng)前對于MTB的富集方法主要是利用化學(xué)培養(yǎng)基培養(yǎng)來實現(xiàn)，Blakemore等[16]使用一種以奎尼酸鐵和琥珀酸鹽作為鐵離子來源和碳源的化學(xué)培養(yǎng)基富集到了淡水湖中的微好氧雙鞭毛磁螺菌，這種培養(yǎng)基沿用至今，可對好氧及微好氧MTB進行分離及純化。實驗室針對MTB的收集主要有3種方法:一是用根據(jù)Matsunaga的反扣法設(shè)計的MTB收集器收集[17-19]；二是用磁泳法收集，也可二者聯(lián)用分離出不同種類的MTB[20]；三是電磁誘導(dǎo)法收集，即利用通電螺線管產(chǎn)生磁場誘導(dǎo)MTB的原理進行收集[21]。

收集之后需要根據(jù)研究內(nèi)容對收集到的MTB進行篩選。目前篩選MTB的方法一般是通過電子顯微鏡觀察，并結(jié)合菌落顏色進行觀察或使用Cmag法，而分離一般是用磁偶極子或誘導(dǎo)偶極子在磁場梯度的作用下拉下目標細菌。由于MTB的運動難以準確控制，會增加篩選難度。在最近發(fā)表的研究中，Tay等[22]開發(fā)了一種可以根據(jù)MTB的表型分離AMB-1的磁棘輪系統(tǒng)，可以自動、實時、定量篩選MTB。該磁棘輪篩選平臺使用了高磁導(dǎo)率的鎳鐵導(dǎo)磁合金，合金柱水平排列組成微柱陣列，形成一個持續(xù)且循環(huán)的磁場，磁場產(chǎn)生的強大移動磁勢陷阱可以捕捉AMB-1從而限制AMB-1的運動，在棘輪芯片上的AMB-1的傳輸受磁力的平衡控制而減少運動對篩選造成的影響。通過對磁場磁力的控制，可以篩選出不同類型的MTB。由此篩選得到的AMB-1可含有比一般AMB-1數(shù)量多2.2倍的BMs(大約25個)。

2 磁小體的基本特性及特點

2.1 磁小體的結(jié)構(gòu)及組成

BMs是一種由趨磁細菌產(chǎn)生的磁性納米粒子，其主要結(jié)構(gòu)分為外部生物被膜與內(nèi)部礦物晶體兩部分。BMs膜主要由磷脂、脂肪酸以及大量與BMs形成相關(guān)的近蛋白質(zhì)(BMs膜蛋白Mam、磁粒子膜蛋白Mms等)組成，與生物體內(nèi)的細胞膜系統(tǒng)成分相似[23]，是由MTB細胞膜內(nèi)陷形成。礦物晶體主要是由磁鐵礦(氧化鐵，F(xiàn)e3O4)或膠黃鐵礦(硫化鐵，F(xiàn)e3S4)礦物組成[15]，晶體大小約為30-120 nm，經(jīng)常使用的AMB-1和MSR-1所產(chǎn)BMs晶體直徑為45-55 nm，個體形狀一致[1]，均為單磁疇磁性顆粒[24]。在高分辨率透射電鏡的觀察下，目前可以培養(yǎng)得到的MTB的BMs晶體結(jié)構(gòu)主要有方形、矩形、六角形或子彈頭形等，而這些結(jié)構(gòu)都是基于立方體、八面體以及十二面體的延伸。不論是氧化鐵晶體還是硫化鐵晶體在室溫下均具有永久磁矩，便于磁化。此外，在BMs中還發(fā)現(xiàn)了一些微量的其他金屬元素的存在，如銅、金和鈣等[25]。

2.2 磁小體的基本特性

BMs獨特的組成和結(jié)構(gòu)給予其生化上與眾不同的特性，在各領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

2.2.1 磁小體表面膜修飾多樣性與生物相容性

BMs表面包被的生物膜富含磷脂和蛋白質(zhì)，整體帶負電[26]，目前已有大約30種特異性蛋白被證實出現(xiàn)在BMs膜上，因而BMs表面膜結(jié)構(gòu)具有多態(tài)性，可以利用其表面的特異性基團進行人工修飾使BMs具有不同的功能特性[27]，如利用人血清白蛋白包裹磁鐵礦可以作為藥物的靶向運輸載體和磁共振成像(MRI)的增強劑[28]。BMs膜由MTB天然形成，因而與一般的生物膜成分類似，具有很好的生物相容性[29]，可參與藥物靶向治療或癌細胞檢測。

2.2.2 磁小體的磁性與磁熱效應(yīng)

BMs在MTB菌體內(nèi)成鏈式結(jié)構(gòu)，使之成為了細胞的“磁鐵棒”，可以感受地磁場的變化，進而對MTB進行地磁導(dǎo)航，使得MTB在水體中長距離定向運動甚至克服逆流，此特性不僅可用于研究BMs作為藥物靶向載體在體內(nèi)的運動，還可用于研究地球地磁場的變化[30]。BMs還具有超順磁性，即當(dāng)外加磁場時BMs可以受外加磁場的引導(dǎo)，而撤掉外加磁場后BMs不再受其影響[31]，因而可用作MRI的增強劑[32]。作為鐵磁體的一種，BMs同樣具有磁熱效應(yīng)，即在絕熱的磁場條件下，BMs的溫度隨磁場強度增大而升高，可在癌癥熱療中使用BMs來提高治療的針對性。此外，基于法拉第電磁感應(yīng)定律，純化后的BMs和MTB可以在螺線管中發(fā)電[33]。

2.2.3 磁小體的低毒性

BMs在低濃度下不會對生態(tài)系統(tǒng)造成任何影響[34]。目前的研究主要針對人體紅細胞、WBC、小鼠巨噬細胞系(J774)、洋蔥根尖和魚(Oreochromis mossambicus)等多種模型對BMs的毒性進行評估。在以上模型中生物體存活率均高于90%。在體外純化和滅菌后的BMs對于小鼠成纖維細胞也是無毒的[35]。此外，在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)昆蟲學(xué)的研究上，磁性納米顆粒(MNPs)對于疾病惡性瘧原蟲和登革病毒的傳播載體—蚊子的幼蟲和蛹都是有毒性的，這些毒性可以幫助研究人員研發(fā)抗疾病傳播的BMs藥物[36]。

2.3 磁小體的獲取方法

以BMs為研究對象，我們需要得到數(shù)量盡可能多、純化程度高的BMs顆粒。目前被廣泛使用的獲取BMs的方法主要有物理破碎和化學(xué)消化兩種，這兩種方法也可疊加使用。物理破碎的一般流程為使用緩沖液或者蒸餾水將待處理MTB細胞充分懸浮，使用法式壓榨機擠破細胞，之后使用超聲波破碎裝置將細胞破碎，然后通過離心外加釤鈷磁鐵的方式除去除BMs以外的其他物質(zhì)，最后收集BMs[35, 37]?；瘜W(xué)消化在物理法的基礎(chǔ)上去掉了破碎的過程，增加了使用化學(xué)試劑或者酶消化細胞物質(zhì)的過程，同樣使用緩沖液或者蒸餾水清洗后離心，磁鐵收集BMs[38-39]。二者聯(lián)用效率更高，如在2011年新發(fā)明的一種純化BMs的方法中，Guo等[39]用高壓勻漿器破壞細胞，用低功率超聲波和尿素處理BMs，蛋白酶K去除吸附和表面蛋白，電洗液去除核酸；利用該方法可大大減少純化時間，增加純化效率，也可通過增加層析柱(磁選柱)來提高BMs的純化度。如Grünberg等[40]在物理法離心收集沉淀后，增加了一個MACS柱來收集BMs，在洗脫的過程中可以消除靜電吸附造成的污染，提高BMs的純化程度。

3 趨磁細菌的改造策略

3.1 對趨磁細菌及其內(nèi)部磁鐵礦晶體形態(tài)的改造

環(huán)境對于生物生長、發(fā)育、繁殖影響深遠，Kundu等[41]研究了環(huán)境中高濃度的鋅和鎳對MS-1的生長和BMs形成的影響，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中存在大量的鋅離子時，MTB的長度會隨BMs大小和數(shù)量的增加而增加。鋅作為MTB所需的微量元素，過高的濃度卻沒有對細菌產(chǎn)生毒害作用，根據(jù)這一特性，可以通過在培養(yǎng)基中添加金屬鹽離子(鋅離子)來提高MTB的質(zhì)量和產(chǎn)量。Tanaka等[42]在研究AMB-1的生物礦化過程時發(fā)現(xiàn)，在體外實驗中缺失Mms6基因的突變株形成了晶體面較小的長條形磁鐵礦晶體，而互補組和野生組均形成高度有序的立方八面體晶體，進而推測膜蛋白質(zhì)Mms6在該過程中負責(zé)調(diào)節(jié)BMs晶體形狀，研究表明蛋白質(zhì)通過對金屬離子進行選擇性結(jié)合，推遲晶體成核反應(yīng)，進而調(diào)控BMs形態(tài)大小[43]。通過人工控制Mms6的表達和作用，可以達到改造BMs晶體形狀的目的。

3.2 對趨磁細菌組成的改造

相對于對BMs膜進行修飾，對MTB膜進行改造的研究相對較少。Chen等[44]根據(jù)MTB的能動性和可控性，使用兔抗MO-1細胞多克隆抗體來覆蓋MO-1細胞表面，使用蛋白A來做連接，制造出了簡單的磁性細菌微型機器人，在微流控芯片中，磁導(dǎo)使這種微型機器人移動到病原菌富集區(qū)，攜帶并分離病原菌。

3.3 在趨磁細菌培養(yǎng)中摻雜其他金屬

Li等[45]在MTB培養(yǎng)基中添加鈷離子，得到的BMs利用x射線磁性圓二色性(XMCD)分析，得到了金屬鈷摻雜在BMs內(nèi)的有力證據(jù)。該分析表明由于鈷離子在磁鐵礦的八面體位置中取代Fe離子而與BMs內(nèi)部晶體融合在一起，而且鈷在晶體內(nèi)的分布是不均勻的。Tanaka等[46]根據(jù)最小抑制濃度(MIC)系統(tǒng)分析第一次得到了Cu2+在MTB中最高摻雜度為15.6%，且發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下，MTB更易攝取過渡金屬，可以通過增加培養(yǎng)環(huán)境中的過渡金屬離子Mn2+和Co2+的濃度來提高金屬摻雜度，摻雜金屬鈷培養(yǎng)得到的BMs具有很好的矯頑值和比較低的Verway轉(zhuǎn)變溫度。此外，在生長培養(yǎng)基中添加微量鈷可以顯著地促進MTB的細胞生長和磁體形成[47]。

4 磁小體的功能化策略

4.1 化學(xué)修飾

化學(xué)修飾是指在BMs膜表面連接固定化學(xué)物質(zhì)或?qū)Ms的膜替換為人工合成聚合物。前者主要包括固定化酶，利用交聯(lián)劑連接抗體、藥物，生物素化等，后者主要指BMs重構(gòu)。經(jīng)過化學(xué)修飾后的BMs，可以定向連接其他物質(zhì)，將其原有的表面修飾能力變得更有針對性，能夠更好地應(yīng)用于靶向載藥、病原菌與癌細胞檢測、生物傳感等方面。

4.1.1 固定化酶

固定化酶技術(shù)是用載體將酶束縛在一定的空間范圍內(nèi)、保留其活性、可反復(fù)利用和回收的一項技術(shù)。因此，固定化酶的載體材料不能影響酶的活性，還要保證回收率。Matsunaga等[38]發(fā)現(xiàn)BMs可以用于固定生物活性物質(zhì)，與先前使用的大尺寸磁性白蛋白微球相比，BMs尺寸小且可受磁場控制，可作為良好的固定化酶載體。其研究團隊使用γ-氨丙基三乙氧基硅烷作為連接物分別在BMs和人工磁鐵礦、鋅鐵氧化顆粒上固定葡萄糖氧化酶和尿酸酶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BMs上固定化酶的活性比人工磁鐵礦或鋅鐵氧體顆粒高出整整40倍，而且BMs固定化酶在反復(fù)使用5次后仍保留活性。

4.1.2 交聯(lián)劑-磁小體復(fù)合物

交聯(lián)劑可以作為BMs和特征物質(zhì)之間的黏著劑，對交聯(lián)劑的要求是:不影響磁BMs和特征物質(zhì)的活性，保證二者的穩(wěn)定連接。針對不同特征物質(zhì)選用的交聯(lián)劑種類與數(shù)目不同，主要的特征物質(zhì)有抗體、藥物、探針等。Xiong等[48]在之前研發(fā)出高磁化、均勻尺寸和正電荷的氧化鐵磁性納米團(MNCs)的基礎(chǔ)之上，生產(chǎn)出了高性能富集循環(huán)腫瘤細胞(CTC)的仿生磁小體(IMSs)(圖 2)。使用靜電相互作用，將MNCs與白細胞膜片段結(jié)合起來形成具有細胞同源性的磁性納米顆粒(LMNC)，當(dāng)仿生磁小體在外周血中遇到白細胞時就能產(chǎn)生排斥，從而降低富集背景中的白細胞干擾。在白細胞膜片段外表面結(jié)合上疊氮化物(N3)，之后使用點擊化學(xué)將二苯環(huán)辛烯組修飾的抗體(DBCO-Ab)結(jié)合到疊氮化物上形成高富集效率的仿生免疫磁小體。大約90%的罕見腫瘤細胞都能在15 min之內(nèi)富集完畢。Pi等[49]使用化學(xué)吸附法，用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二酰亞胺做化學(xué)鏈接劑鏈接黃曲霉素B1多克隆抗體和BMs來提取黃曲霉毒素B1。Deng等[26]根據(jù)BMs表面存在大量氨基酸殘基和蛋白質(zhì)，富含磷脂酰乙醇胺而帶負電的特性，利用雙功能交聯(lián)試劑GP實現(xiàn)癌癥藥物阿拉伯胞嘧啶糖苷(Ara-C)與BMs表面氨基酸殘基的連接，減少癌癥藥物的副作用。Dai等[50]利用聚乙烯亞胺(PEI)作為交聯(lián)劑合成BMs-PEI-siRNA復(fù)合體。PEI是一種聚合物基體，可以用于傳遞DNA、siRNA以及寡核苷酸；通過靜電相互作用，將上述基因片段裝載在PEI上，PEI對siRNA還有保護作用，可以防止其被核糖核酸酶降解。

圖 2 免疫磁小體（IMSs）的構(gòu)建和CTC富集過程[48]

4.1.3 生物素化磁小體

利用生物素對BMs表面進行修飾，以鏈酶親和素(STV)為連接體，可將各種生物素化的物質(zhì)連接在BMs上。Ceyhan等[51]利用BMs表面豐富的基團對BMs進行了改造，實現(xiàn)了對核酸的檢測(圖 3)。首先BMs表面生物素化:可以使用生物素化的脂質(zhì)生物素-DPPE直接參與脂膜形成，也可以利用NHS-生物素對BMs表面蛋白質(zhì)進行修飾，使其表面攜帶生物素；然后使用STV與生物素進行連接，形成STV-biotin-MPs復(fù)合物，接下來，可以使用生物素化的多種物質(zhì)進行連接。例如，生物素化的寡聚核苷酸(DNA)用于檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)[52]、生物素化的抗體用于制備免疫磁珠[53-54]等，上述連接物質(zhì)還可同時連接。利用生物素化BMs還可將檢測SNP的分子探針交聯(lián)在BMs表面，如Ota等[52]設(shè)計出了僅有9個堿基長度且具有特異性的分子探針用于檢測TGF-β1的SNP并使用NHS-生物素修飾BMs，利用STV將同樣生物素化的DNA固定在BMs表面，隨后Matsunag等[55]利用同樣的修飾方法，基于等位基因特異性寡核苷酸雜交和生物素化BMs顆粒進行熱離解曲線分析的半自動化系統(tǒng)對SNP進行高通量檢測，與傳統(tǒng)的基于序列的方法相比，基于半自動化的BMs的SNP檢測系統(tǒng)具有高可靠性。

圖 3 半合成鏈霉親和素-生物素-磁小體模型示意圖[52]

4.1.4 磁小體重構(gòu)

BMs重構(gòu)指的是BMs結(jié)構(gòu)的重新組裝，包括BMs單獨個體的重構(gòu)，也包括BMs整體的重構(gòu)，這種重構(gòu)一般是將BMs膜去除后包裹其他聚合物等物質(zhì)，經(jīng)過重構(gòu)的BMs可獲得某方面的特殊性質(zhì)。Yoza等[56]就將BMs膜去除，使用具有多氨基的3-[2-氨基乙基]-乙基胺基-乙基甲氧基硅烷(AEEA)重新包裹BMs內(nèi)的晶體(圖 4)，使得重構(gòu)后的BMs表面陽離子增多，可與帶負電的DNA充分結(jié)合，DNA提取率高；再使用一種樹狀的多胺(PAMAM)分子通過級聯(lián)反應(yīng)在改造后的BMs表面生成一種致密的外胺殼。隨外殼層數(shù)增加，胺濃度上升，進而陽離子數(shù)目的大量增加有助于生成膠體懸浮液，增加表面積，用于DNA提取。該外殼還可減少BMs之間的聚集，增加分散性。Matsunaga等[57]利用BMs表面蛋白A-LgG的結(jié)合域?qū)⑸锼貥擞浀腂Ms固定在具有條紋聚苯乙烯微球上，構(gòu)建了微球-磁小體復(fù)合物，以增加其分散性和磁性，這種復(fù)合物的檢測效率比單獨使用BMs高，而且檢測上限大，可用于開發(fā)高通量、全自動的生物分析工具。

圖 4 重構(gòu)磁小體的結(jié)構(gòu)[56]

（黑色部分：磁體礦晶體；內(nèi)層：AEEA；外層：PAMAM）

4.2 生物修飾

生物修飾主要是將生物成分加工到BMs結(jié)構(gòu)中，或者利用MTB的生物礦化過程將物質(zhì)帶入BMs內(nèi)部，如通過蛋白質(zhì)、多肽等代替交聯(lián)劑連接抗體，使BMs表面攜帶綠色熒光蛋白(GFP)等。

4.2.1 蛋白質(zhì)/多肽-磁小體復(fù)合物

在化學(xué)修飾中提到的多種化學(xué)交聯(lián)劑，雖然交聯(lián)能力強，但用量大、價格昂貴，還存在所連接抗體取向不一，可變區(qū)與BMs連接的問題。使用多樣化的蛋白質(zhì)或多肽來替代交聯(lián)劑也可達到相近的效果，甚至還可實現(xiàn)使用交聯(lián)劑達不到的效果。例如，同樣是連接抗體，可以利用金黃色葡萄球菌的胞壁蛋白蛋白A基因與磁細菌MSR-1膜上表達量最多的MamC和表達量第二多的MamF基因整合后表達出融合蛋白，重組之后的BMs可以與多數(shù)哺乳動物IgG的Fc片段結(jié)合形成功能性BMs[58-59]。Takahashi等[60]通過使用MmsC-NS多肽鏈融合蛋白的方式將由4個天冬酰胺和1個絲氨酸殘基組成的長度為100個氨基酸的NS多肽鏈修飾在BMs表面，多肽鏈末端可連接蛋白G，該復(fù)合物增強了BMs的分散性和特異性結(jié)合能力。

4.2.2 熒光蛋白-磁小體復(fù)合物

Lang和Schüler等[61]通過將GFP基因與相關(guān)蛋白質(zhì)基因共表達，形成融合蛋白，使BMs表面蛋白質(zhì)攜帶熒光基團。小組用這種熒光蛋白-磁小體復(fù)合物，在流式細胞法、熒光顯微鏡和生物化學(xué)分析等幫助下，研究了微好氧MTB中融合蛋白在BMs中的定位和表達。該方法克服了相互排斥的高熒光和磁鐵礦合成的矛盾，建立了可以保證MTB正常生長、正常進行生物礦化和GFP熒光團正常形成的最佳(氧氣)條件。并在這些優(yōu)化的條件下，利用熒光顯微技術(shù)和免疫印跡技術(shù)，研究了GFP標記的MamC，MamF和MamG的胞內(nèi)定位和表達。其中MamC-GFP表現(xiàn)出最強烈的熒光(表達量最高)，純化得到的MamC-GFP所標記的BMs對洗滌劑敏感，但在廣泛的溫度和鹽濃度范圍下穩(wěn)定。該研究團隊認為GFP融合蛋白熒光標記法最適合用于MamC的檢測。根據(jù)MamC與GFP的高適應(yīng)性，Mickoleit等[62]在基因改造的水平上，利用酶陣列基因表達，制備出了具有放大催化活性的多功能BMs(圖 5)。他們使用5個大腸桿菌β-葡糖醛酸酶(GusA)構(gòu)成一個酶的微陣列，并與熒光團mEGFP基因(即細菌的增強型GFP)、BMs膜表面表達量最多且具有親水性N端的MamC融合，高度表達形成雜合蛋白，修飾在BMs表面，3個蛋白質(zhì)的基因位于同一啟動子之后。其中mEGFP蛋白與MamC連接后，可以穩(wěn)定并增強BMs的熒光[63]，MamC起到了膜定位的作用。即使增加GusA單體的數(shù)量也不會影響B(tài)Ms磁性、熒光以及催化活性的穩(wěn)定性，可為將BMs應(yīng)用于醫(yī)療提供便利。

圖 5 mEGFP-（GusA）s-MamC在磁小體中的基因設(shè)計（A）和表達效果（B）示意圖[62]

5 磁細菌的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用

5.1 在重金屬污染廢水中的應(yīng)用

工業(yè)生產(chǎn)如電鍍、電子設(shè)備制造廠排放廢液中的重金屬離子會污染環(huán)境(如鉛、銅、鎳和鎘等)，破壞生態(tài)，有時我們也需要對廢液中的重金屬離子進行二次回收生產(chǎn)其他產(chǎn)品。化學(xué)沉淀法、溶劑萃取法、離子交換法等許多傳統(tǒng)方法都有助于緩解這種危害性。但是當(dāng)金屬離子濃度低于100 mg/L時，所有這些方法都是高成本且無效的，有些甚至?xí)斐啥挝廴綶64]。MTB在磁場下可以實現(xiàn)對廢液重金屬離子的吸附，這種生物吸附法是環(huán)保的，如MTB對Pd/AL廢液系統(tǒng)的吸附，無論是對Pd2+還是對AL3+吸附過程都十分快速，其中對Pd2+具有優(yōu)先吸附性，二者的吸附均符合擬二階吸附動力學(xué)模型。并且隨著磁場強度的增加，分離效果提高的同時，分離速率也會顯著提高[65]。此外，MTB還可實現(xiàn)對Cr[66]以及Cu[64]等其他金屬離子的吸附回收。

5.2 在生物學(xué)、地理學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用

在生物學(xué)方面，對于古MTB化石的研究有助于科學(xué)家探究地球生命的起源問題[67]。在地理學(xué)層面，MTB可幫助我們恢復(fù)古環(huán)境、了解沉積剩磁狀況和推測古地磁方向。在35億-38億年前，古MTB已在地球上出現(xiàn)，其生長發(fā)育、BMs的生物礦化過程與環(huán)境密不可分，在地磁場線排列和運動也與地磁場的變化聯(lián)系緊密。彭先芝等[68]收集了不同環(huán)境黃土剖面L6-S5-L5層段中的MTB，通過對其形態(tài)大小、數(shù)量以及BMs結(jié)構(gòu)的研究，發(fā)現(xiàn)MTB的分布與古環(huán)境氣候存在聯(lián)系，并以此推測出了黃土高原古氣候頻繁波動的狀態(tài)和自北向南的變化趨勢。MTB在醫(yī)學(xué)方面的研究潛力無限，2014年，Chen等[44]利用金黃色葡萄球菌胞壁蛋白A連接兔抗MO-1細胞多克隆抗體和磁細菌MO-1，制造出了簡單的磁性細菌微型機器人。該機器人可在微流控芯片中，受磁導(dǎo)移動到病原菌富集區(qū)，攜帶并分離病原菌。該方案可能將在未來醫(yī)學(xué)檢測中被廣泛應(yīng)用。

6 磁小體的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用

6.1 在食品檢測中的應(yīng)用

BMs經(jīng)過功能化修飾后可攜帶抗體成為免疫磁珠，與食品中的病原菌或毒性物質(zhì)特異性結(jié)合達到分離效果，通過連接一些檢測裝置達到檢測的效果[69]。Xu等[59]使用生物修飾法構(gòu)建了LgG-SpA(金黃色葡萄球菌胞壁蛋白A)-磁小體復(fù)合物，并結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)用于檢測海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌的數(shù)量，結(jié)果表明，一毫克的復(fù)合物能夠捕捉多達1.74×107個弧菌細胞。Pi等[70]利用黃曲霉毒素B1多克隆抗體和BMs制備免疫磁珠探針提取植物油中的黃曲霉毒素B1。他們使用化學(xué)吸附法通過1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二酰亞胺做化學(xué)偶聯(lián)劑連接黃曲霉毒素B1多克隆抗體和BMs，與傳統(tǒng)的Fe3O4磁性納米顆粒-黃曲霉毒素B1抗體探針相比，該免疫磁珠在植物油中對黃曲霉毒素B1的吸收高出28倍，回收率高達93.7%；Wu等[71]使用同樣方法構(gòu)建出的葡萄球菌腸毒素B(SEB)抗體-磁小體復(fù)合物可回收并檢測牛奶中的SEB，檢測范圍為0.05-5 ng/mL，回收效率高達118%；Peng等[54]利用免疫磁珠分離技術(shù)結(jié)合熒光標記DNA適體文庫作為直接特異性報告者，快速檢測了豬仔體內(nèi)的大腸桿菌K88。

6.2 在癌癥治療中的應(yīng)用

BMs具有良好的生物相容性、超順磁性和低毒性，體積微小且均一，相比于人工磁性納米粒子而言，天然產(chǎn)生的BMs在癌癥治療中舉足輕重。BMs不僅僅可以作為MRI的對比劑，還可以作為MRI的特異性標記分子與成像探針[72]。Boucher等[72]使用生物修飾法，構(gòu)建腦瘤整合素合成必需RGD肽表達載體，實現(xiàn)BMs表面Mamc-RGD肽融合蛋白的表達，并使用熒光蛋白作為標記基因，增加MRI檢測腦瘤細胞的特異性。在交變磁場控制下，BMs可侵入腫瘤細胞，從而抑制腫瘤細胞增殖。根據(jù)BMs這一特性可以將清除腫瘤細胞的藥物與BMs結(jié)合在一起，實現(xiàn)藥物靶向運輸，增加腫瘤治療的特異性和靶向性。余水生團隊[73]使用BMs靶向運輸阿霉素/pHSP70-shPLK1雙重藥物實現(xiàn)了對骨肉瘤的治療。利用生物修飾法，他們將構(gòu)建的pHP70-shPLK1載體導(dǎo)入BMs內(nèi)部，并使阿霉素均勻覆蓋在BMs表面，該復(fù)合物可有效降低腫瘤細胞的增殖、侵染能力，提高腫瘤細胞的凋亡率。Deng等[26]利用化學(xué)修飾法通過雙功能交聯(lián)試劑GP實現(xiàn)藥物Ara-C與BMs表面氨基酸殘基的連接，減少癌癥藥物的毒性。在磁熱療方面，BMs可充分發(fā)揮它在磁場中的熱特性[74]，增加升溫的針對性，縮小升溫的范圍，從而提高了腫瘤細胞的死亡率而減少了副作用，將磁熱療技術(shù)與免疫磁珠聯(lián)用，還可用于體內(nèi)滅菌，Chen等[44]利用該法發(fā)現(xiàn)50%與MTB發(fā)生接觸的金黃色葡萄球菌經(jīng)過磁熱作用后死亡。

7 總結(jié)和展望

總體來說，目前對于MTB的改造策略主要通過改變菌體內(nèi)BMs的形態(tài)和組成等間接達到改造MTB的目的，且MTB主要用于廢水中重金屬的吸附和去除。對于BMs的功能化策略，主要分為化學(xué)修飾法和生物修飾法，通過在BMs膜的表面修飾上各種功能活性基團比如酶、抗體、核酸、藥物等將BMs應(yīng)用于醫(yī)療、檢測等各個領(lǐng)域。

對MTB直接進行改造，可借鑒BMs功能化方法，利用MTB膜表面的活性基團在其表面共價或非共價修飾上各種物質(zhì)；或采用融合蛋白法，使MTB膜表面上的某一種蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或其他生物分子等大量生成，利用MTB膜表面這些大量生成的生物分子來連接功能活性物質(zhì)；這可大大拓寬MTB的應(yīng)用范圍。另外，目前向MTB的BMs磁鐵礦晶體內(nèi)摻雜金屬仍處于研究階段，且研究主要局限于過渡金屬，應(yīng)用極少?？墒褂酶缓珻o2+的培養(yǎng)基得到摻雜金屬Co的BMs；其具有較強的矯頑力，穩(wěn)定性較好，且無毒害作用，可用于提高磁熱療的效果。

此外，BMs目前主要應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域作為藥物遞送載體、MRI造影劑或成像探針等。而在檢測領(lǐng)域主要通過在BMs表面修飾上抗體，利用抗原抗體之間的特異性免疫反應(yīng)來吸附病原菌、病毒、毒素等靶物質(zhì)，進而實現(xiàn)對目標物質(zhì)的檢測，方法較單一。這是今后基于BMs構(gòu)建檢測技術(shù)需要克服的關(guān)鍵問題之一?？贵w穩(wěn)定性較差，易失去活性，制備成本高；而功能核酸穩(wěn)定性好，形式多樣且易于制備。因此，可以利用BMs表面豐富的氨基共價修飾上核酸并利用BMs的天然磁性實現(xiàn)對金屬離子、生物小分子等其他靶物質(zhì)的高效檢測。還可以將功能化BMs與試紙條等檢測技術(shù)聯(lián)用，實現(xiàn)靶物質(zhì)的快速檢測等。

參考文獻：略