微流控(microfluidics)技術是一種針對極小量 (10-9 ~10-18 L)的流體進行操控的系統科學技術. 微流控芯片(microfluidic chips)是微流控技術實現的主要平臺和技術裝置, 其主要特征是容納流體的有效結 構(通道、反應室和其他某些功能部件)至少在一個維 度上為微米級尺度. 在這一尺度下, 流體的運動具有 自己的特點, 與宏觀尺度大不相同. 隨著半導體微加 工工藝技術在微流控芯片制備中的廣泛應用, 以及 使用彈性材料多層構建等新技術的發展, 人們已經 可以將多種功能性的元件和結構規模集成在一塊幾個平方厘米大小的芯片上. 我們將這種包含多種結構或多個功能的、精確可控的復雜微流控芯片稱之為 “集成微流控芯片”。

化學及現代生物學的大部分實驗都是在溶液狀 態下進行的, 這些實驗都需要盛裝液態物質的容器, 例如燒杯、燒瓶、試管、培養皿等; 也大量涉及到液 體的轉移與輸運器材, 例如移液管、滴管、量筒、各種管材等. 在這些實驗中, 通常所運用的體積單位是 毫升(常見于化學實驗)和微升(常見于生物學實驗). 在與生命科學相關的研究中隨著通量的上升和樣品 量的限制, 我們所研究的體系開始使用更小的體積 尺度, 這就需要我們用新的技術手段來進行更小尺 度下的實驗操作與觀測. 微流控芯片就是在這樣的 一種需求下應運而生的技術, 用以進行微量甚至極微量液體的操縱與分析。

1975 年, 斯坦福大學的 Terry 等人在硅片上制作了第一個小型的氣相色譜分析儀, 這個儀器中的關鍵部件是一個在硅片上通過微加工手段蝕刻的微 細通道, 可以形象地看作是一根利用硅片制備的毛 細管類似物. 這個芯片可能是第一個現代意義上的 實用型“微流控”器件. 它的特點是體積小、分析所需時間短, 但是由于技術限制, 這種硅芯片并未引起廣 泛重視. 隨后, 微流控技術的發展相對緩慢, 直到 1990 年 Manz 等人提出“微全分析系統(micro total analysis system, mTAS)”的概念, 才進入了迅速發展 的時期. 微全分析芯片的概念具有很強的吸引力, 它的主要特點是將待分析樣品的前處理、分離以及檢測 等步驟高度集成化, 在一塊芯片上完成. 隨后的近 20 年時間內, 在潛在應用前景的鼓舞下, 微流控技 術的發展速度大大加快. 同時, 以微電子加工和微機 電加工為背景的微加工技術不斷發展, 達到了一個 相對成熟的時期, 為微流控芯片的加工和推廣提供了技術平臺, 并使得芯片制作的成本得以大大降低。

如今, 微流控分析芯片特別是具備高密度、大規 模、高通量、多功能等特點的集成微流控芯片已經在 化學和生物學領域發揮著重要的作用. 與宏觀尺度 的實驗裝置相比, 這一技術顯著降低了樣品的消耗 量, 增大了流體環境的表面積, 提高了反應效率, 同 時也降低了實驗產生廢物對環境的污染; 集成微流 控芯片操作的并行性優勢可以實現實驗的高通量、自 動化控制; 并且通過微閥微泵等微細結構的精確控 制, 微流控芯片在提高生命科學研究的時間與空間 分辨率上有很大的靈活性, 具有不可替代的優勢。

1.集成微流控芯片的制備

微流控芯片所使用的材料是多種多樣的, 早期的芯片制備中硅和玻璃成為最重要和最常見的材料. 這些材料的加工工藝比較成熟, 通過光刻等圖案化 手段可以使玻璃基片的特定圖案暴露而其余部分被 光刻膠或者金屬鍍層所保護, 再利用氫氟酸或其緩 沖蝕刻劑(例如氫氟酸和氟化銨混合溶液)與暴露部 分的玻璃反應, 腐蝕出凹槽. 這些凹槽的上部同另一 平整表面封接后就形成了管道, 完成了微流控芯片的構建. 這種利用玻璃腐蝕工藝制作微流控芯片的技術被廣泛用于芯片電泳的應用中. 這類材料同時具有一定局限性, 因為它們通常具有很大的剛性, 在 玻璃或者硅片上要想實現微全集成所必需的微泵和微閥等單元的制作是非常困難的. 同時硅片在紫外 及可見光區不透明, 限制了其用于光學尤其是激光誘導熒光的檢測. 玻璃材料制備的微流控芯片在電泳分離與分析上應用方便, 但其在制備過程中對工藝的要求相對比較嚴格, 在大多數傳統的化學與生 物學實驗室內不易推廣. 這一類材料制備的芯片在 集成度上往往受到限制, 難以取得方法學上的突破. 要實現大規模、高通量、多功能的集成, 需要發展更 合適的加工方法與新的制備材料. 1998 年, 美國哈佛大學 Whitesides 研究組提出了軟蝕刻(soft lithography) 的概念, 并且演示了應用模型復制的快速成型法制作微流控芯片的技術, 這一技術在幾年內得以拓展, 成為一種新型的微加工手段, 從此宣告微流控芯片進入了以聚二甲基硅氧烷(poly(dimethyl siloxane), PDMS)為關鍵材料的時代. 利用 PDMS 材料制備微 器件的一個主要特點是加工方便, 不需要特別苛刻 的實驗條件和昂貴的加工設備, 這一優點促使微流控芯片又進入了新一階段的快速發展時期. Effenhauser 等人最先用 PDMS材料做成微流控芯片用于 DNA 分析, 整個芯片利用電滲流來控制. 芯片的制備不再神秘, 普通的實驗人員也可以輕松完成。

軟蝕刻方法的基本制備過程如圖 1 所示. 首先利用計算機輔助, 通過合適的程序進行管道設計; 之后制備光刻掩膜, 由于許多芯片中流體管道的寬度處在幾十至幾百微米的量級, 甚至可以使用高分辨 率的打印機將管道設計圖打印在透明膠片上替代價 格昂貴的傳統鉻版掩膜; 再將光刻掩膜利用光刻技術將掩膜圖案轉移到涂有光刻膠的硅片上. 以SU-8負性光刻膠為例, 需要聚合的區域通過掩膜的透明 部分接受紫外照射后發生交聯反應而聚合, 未經過紫外照射的區域則可以被顯影液溶解, 之后硅片及其表面上剩下的突起的SU-8 結構構成制作 PDMS 微 流控芯片的陽模. 做好模板后, 首先將模板硅片用含 惰性基團(如氟代烷基)的硅烷處理以防止下一步操作時PDMS和硅片的永久鍵合. 然后將 PDMS 預塑 體(由兩種不同化學官能化的硅氧烷組成, 按照一定比例混合)澆鑄到模板硅片上, 之后將其處于 40℃ ~80℃加速 PDMS 預塑體固化, 再將固化后的 PDMS 從模板上揭下來, 用打孔針在合適的位置上打孔作 為溶液的進出口, 最后將 PDMS 基片帶有管道的一 面與其他平面結合, 進行可逆或不可逆性的密封完成芯片制作.

圖 1 基于軟蝕刻技術的芯片快速復制法

軟蝕刻技術的出現, 為制備集成微流控芯片, 尤其是與集成電路相類似的多功能、高密度集成微流控芯片, 開辟了一條新的道路. 2000 年, 美國加州理工學院的 Quake 研究組發明了多層軟蝕刻技術 (multilayer soft lithography), 巧妙地利用了 PDMS 材 料的彈性性質和聚合特性, 在芯片上整合了可以快 速、準確控制流體流動的微型氣動閥, 實現了在芯片 上高密度流體運動的控制, 為高通量大規模的功能 集成提供了可能性. 兩年以后, 他們以“微流控大規 模集成芯片”為題報道了集成有上千個閥門和上百個 微反應室的PDMS芯片, 實現了微流控芯片由簡單 的單元操作到規模集成芯片的飛躍. 多層軟蝕刻 技術是傳統軟蝕刻技術的重要拓展, 它通過創造三維交疊管道以實現簡單有效的流體運動控制, 主動 閥的功能即是通過在芯片中相互交叉的立體管道來 實現. 當對下層(控制層)施加正氣壓時, 處于兩層之 間的薄膜會產生向上的變形, 如果氣壓足夠, 可以很 好地封閉住上層(流體層)(圖 2). 該種主動閥的反應 時間為毫秒量級, 壓力在 100 kPa 量級. 用同樣的方 法, 他們在一條簡單的流體管道上平行排列了三個 控制閥, 構成一種蠕動泵. 這種通過多層軟蝕刻技術 制備的主動閥有體積小、密封性好、透光性好、響應 快、可精確驅動、高度集成化、使用時間長、制作簡 單、成本低等優勢, 被廣泛使用到高通量的集成微流 控芯片中. 這一技術在集成微流控芯片短短的發展 歷程中具有里程碑意義, 極大地推動了微流控技術 在化學和生命科學領域的應用, 并解決了許多傳統技術或者單一功能芯片無法解決的難題.

圖2 利用多層軟蝕刻制備微流控壓力可控閥門的示意圖

1.集成微流控芯片的應用

2.1 集成微流控芯片在細胞培養與控制中的應用

細胞是生命的基本組成單元, 細胞生物學是生命科學研究的基礎之一. 我們已有的許多認識是建 立在針對大量細胞的系綜平均結果基礎上的, 但是 近年來的深入研究使許多生命現象的發生過程已經 無法從系綜平均上得以闡明, 在少量細胞乃至單個 細胞層次上進行生命科學的研究呈現出了迫切的重 要性. 絕大多數細胞的大小位于微米尺度, 正好同微 流控芯片中的通道大小相適應, 這一匹配為少數或 者單個細胞的操控提供了極為便捷的條件. 集成微 流控芯片在操作上很強的可控性同時為進行原位的 細胞培養以及動態實時的微環境調控提供了可能性, 在小體積內進行這樣的實驗還可以同時保持合適的濃度、較短的傳質時間、較快的時間響應和長時間的動態追蹤等.

集成微流控芯片在發揮高通量優勢同時, 可以鎖定單個細胞, 成功地進行細胞受激反應和調控的長時間動態觀察與研究, 同時可以觀察細胞間通訊 對于細胞生長的調節機制, 得以了解生物體反饋機 制的真正奧秘, 而不是由于系綜統計數據造成的假 象. 如果能夠定量的進行單細胞分析, 將會對生命過 程的細節有更深刻的認識. 斯坦福大學的 Zare 研究 組[11]利用液體在微流控通道內層流的特點實現了對 單個 Jurkat T 細胞的俘獲、破膜、染色、特定分子檢 測等多個分析步驟, 得到了在刺激下不同單細胞的 響應, 實驗結果表明, 基于單細胞的分析手段可以揭 示許多在多細胞分析中被掩蓋的個體區別, 對于理 解細胞應激響應有重要作用. 當然這種依靠層流方 式來獲取一個一個單細胞的方法很難發展成為高通 量的技術, 而且工作條件對穩定性有很大影響, 通量 也很難得以擴大.

為了實現高通量的實驗, 加州大學伯克利分校 的 Lee 研究組提出了一種在微流控芯片中加工大規 模的微攔截陣列以批量攔截單細胞的方法. 利用 PDMS芯片的雙層結構, 在攔壩的下方與基底之間有2μm的縫隙, 允許液流通過但細胞卻無法通過而被 攔截, 這一簡單的流體動力學方法即可以將細胞有 效地俘獲, 通過改變攔壩的形狀還可以控制每個攔壩可以攔截的細胞數量. 作者利用熒光分子探針分 析了單個細胞中羧基酯酶的活性, 展示了這種系統 可以高效率地實現單細胞的分析研究, 是一種高密 度顯微成像的單細胞定量分析方法. 格拉斯哥大學 的 Cooper 研究組借鑒這種單細胞攔截陣列的方法, 對單腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的反應動力學進行了研 究. 細胞在芯片的攔壩上受到的剪切力較小, 結果表 明這種高內涵(high content)顯微分析的方法對細胞 凋亡的有效評估可以與流式細胞儀相比擬, 而且需 要的試劑量大大降低, 操作也更為簡便[13]. 在傳統 的藥物篩選過程中常常需要大量的細胞培養、多條件 的篩選和專業化的人員配備, 而集成微流控芯片高 通量、并行化、自動化的特點非常適合于藥物篩選的研究. 麻省理工學院的 Thorsen 研究組報道了 一種并行裝載并培養細胞的陣列芯片裝置, 用于藥 物毒性的篩選. 細胞裝載管道與毒素刺激物的管道 相垂直, 在兩種管道的交匯處有圓形的細胞捕獲小室, 每個小室中包含 8 個 U 型的細胞捕獲結構, 經過 流體力學計算和設計使得這些結構可以均一地捕獲 一定數目的細胞, 同時保證每個小室內細胞數量的 相對均勻. 通過合理控制芯片上的氣動閥門, 可以對 許多平行的細胞裝載管道與毒素管道進行單獨控制 操作. 他們在同一張芯片上制作了 576 個細胞培養小 室, 可以同時獲得 3 種細胞(小鼠成纖維細胞, 宮頸 癌細胞, 牛內皮細胞)分別對 5 種不同毒素刺激物(洋 地黃皂苷、皂草苷、CoCl2、NiCl2、丙烯醛)的組合反 應. 該方法將細胞的裝載固定、連續培養、藥物處理 和結果分析等實驗過程全部集成在一塊芯片上.

形成雜交細胞瘤和體細胞重組是生物學研究的 重要內容, 而控制細胞的融合是這些研究的基礎, 也 是實驗中面臨的技術挑戰. 由于傳統的方法很難解 決細胞高效配對與融合的問題, 細胞在大規模上的 隨機配對導致融合的效率不高. 美國麻省理工學院 的 Voldman 研究組采用集成微流控芯片技術, 加工出雙層的大規模微陣列用來攔截細胞. 與簡單的 細胞攔截芯片不同, 他們為了讓不同細胞達到“A-B” 形式的配對, 在每個微攔壩的背部加工了一個只可 容納一個細胞的缺口, 而在正面則加工了一個可以 容納兩個細胞的缺口. 實驗中首先從反方向灌注 A 細胞懸液, A 細胞被攔壩背面的缺口攔截, 每個攔壩 只攔截一個 A 細胞. 然后溶液從正方向灌入, 使原先 攔截在攔壩背面的 A 細胞脫離落入下游攔壩的正面缺口中. 由于層流的作用, 很少會出現兩個細胞占據 一個正面缺口的情況. 最后 B 細胞從正向灌入芯片, 進入正面缺口內剩下的一個細胞空間內, 這樣微攔 壩上攔截了的兩個細胞就基本上成了“A-B”組合(圖 3(a)). 兩個單細胞的融合既可以用聚乙二醇(PEG)輔助, 也可以通過在芯片內上下兩方集成的電極施加 脈沖電位來實現電穿孔融膜. 與傳統方法相比, 微流 控芯片將 PEG 融合的效率從 6%提高到了 25%左右, 將電融合效率從 11%提高到 50%以上, 總體而言, 該方法將細胞融合的效率提高了 3~10 倍, 是對傳統 方法難以控制和實現的問題利用集成微流控芯片得 以解決的一個范例.

在與細胞相關的實驗操作中, 高通量和長時間 的培養常常是必須的步驟. 在培養過程中進行實時 的微環境調控、形態觀察、生化檢測等操作往往會帶 來污染的風險, 對保證實驗的平行性和重現性也帶 來挑戰. Quake 研究組在他們發展的大規模集成微 流控芯片的基礎上提出了一種全過程自動化的高通 量活細胞培養微流控系統[18]. 該系統集成了 96 個可 獨立尋址的微培養腔, 每個微腔的工作體積只有 60 nL, 這種獨立的高通量培養微腔和可控性適合各 種自行設計的細胞培養實驗和篩選研究(圖 3(b)). 作 者在該芯片上培養人間葉干細胞(Human primary mesenchymal stem cells), 研究了短期刺激對細胞增 殖和細胞中堿性磷酸酶活性的影響. 細胞可以在芯 片上連續培養 240 h 以上, 結合自動控制的熒光顯微 鏡可以在無人值守情況下完成整個實驗過程. 這一 成果充分展示了大規模集成的微流控芯片作為一種 新的細胞培養和研究工具的高效性和普適性.

除了通過高通量的實驗獲得大量數據用于統計分析外, 進行高時空分辨的細胞受激響應研究是認 知細胞內部生化反應過程的必要手段. 集成微流控 芯片在實現細胞分析的時間與空間分辨上有很大的 靈活性, 具有不可替代的優勢. 通過芯片的精確控制, 目的細胞可以被分配到芯片上指定的位置, 通過定 時、定點的刺激來實現高通量的細胞刺激并可以實現 原位實時觀測 . 加拿大不列顛哥倫比亞大學的 Hansen 研究組[19]近期一篇報道利用多層軟蝕刻技術 制備的芯片采用半壓閥門控制捕獲懸浮的酵母細胞, 在一塊芯片上集成了 2048 個半壓微閥, 以實現 8 個 細胞系、每個細胞系同時進行 32 種定時刺激、每種 刺激有 8 個并行實驗的全目標. 整個實驗通過自動的實時控制和顯微圖像拍攝來獲取大量數據. 這一實驗展示了高集成度的微流控芯片作為一種新的細胞生物學研究工具, 在系統生物學研究領域具有巨大潛力.

圖3 集成微流控芯片對細胞的操控與全自動培養 (a) 利用芯片的加工對 A 和 B 細胞配對精確控制, 并在芯片上進行高效率細胞融合[17]; (b) 全集成微流控芯片對細胞的全自動化連續培養

集成微流控芯片在細胞培養特別是細胞微環境 控制和單細胞培養上的優勢是明顯的, 芯片體系可 以自動化地進行許多細胞培養、分離、富集以及分析 步驟, 大大減少了人為誤差、人力資源和試劑消耗. 即使與成熟的孔板技術相比, 集成微流控芯片所消 耗的試劑更少、實驗通量更高, 還可以擺脫孔板實驗中邊緣效應的干擾, 具有很好的潛力. 當然, 集成微流控芯片在細胞培養和操控上也存在一些局限性和挑戰. 首先, 芯片可以做得集成度很高, 但是外部的 控制設備過于復雜, 如何簡化芯片的操作, 使之更適 應于化學家和生物學家的工作習慣, 是需要不斷加 以改進的技術問題; 其次, 芯片中細胞以及其他試劑 的注入與回收存在許多芯片外的消耗, 這些消耗存 在于連接管道、移液附件、外置泵體等處, 往往超過 了芯片上的消耗, 如何解決這個“世界到芯片”的界 面問題, 也需要不懈的努力; 第三, 在芯片內, 由于微環境可以精確控制, 且由于體積很小, 傳質轉熱等 過程都比較迅速, 這些環境如何在其他體系中再現, 使許多過程可以移植到更大規模的實驗中, 也常常 成為一個難題.

2.2 集成微流控芯片在核酸與蛋白質研究中的應用

核酸與蛋白質是兩類最為重要的生物大分子, 對核酸和蛋白質的結構、功能及調控過程的認識與研 究為人類在分子水平上研究生命的本質奠定了基礎. 微流控芯片技術是研究核酸和蛋白質的良好平臺: (1) 芯片上的液體消耗量極小, 可以對極微量液體方便 地進行操控, 對于核酸和蛋白質這些生物大分子而 言,可以減少樣品量、增加濃度, 并且有利于實現核酸 和蛋白質的快速并行化分析; (2) 芯片的尺度在微米 范圍, 該尺度下不僅僅傳質和擴散速度很快有利于 分析過程的許多操作快速完成, 而且小尺度還具有 常規尺度下不具備的某些性質如層流, 電滲等可以 很好地應用到分離分析中; (3) 集成化的多功能芯片 實現了在極小尺寸下多個實驗操作步驟的整合 和流程化操作, 在核酸和蛋白質的分析中, 可以從細 胞的培養開始, 通過消化、裂解、提取、富集、純化、 標記、分離、信號放大、結果讀出等多個操作環節, 完 成全部的操作得到最終數據, 有助于減少樣品損失 和避免污染與實驗操作人為誤差.

加州大學伯克利分校的 Mathies研究組報道了 一種用于超高通量基因分析的微流控裝置. 整個裝 置設計在一個直徑為 200 mm 的圓盤狀玻璃片上, 由 384 條以輻射狀排列的毛細微流管道組成. 分析時, 可以將樣品加入到芯片邊緣的儲液池中, 之后樣品 通過 8 cm 長的微流管道進行分離, 最后用自制的四 色旋轉共聚焦熒光掃描儀進行檢測. 利用該裝置, 在 325 s 的時間內完成了 384 個在人的 HPE 基因中與血 色沉著病相關聯的 H63D 突變體的分析. 這種 384 道 微毛細管陣列分析電泳(μCAE)制作簡單, 可工業化 生產, 將會大大提高篩選的速度, 有望成為一種有力 的分析工具. 該研究組最近報道了利用電泳技術在 芯片上對基因沉默細胞群中的單細胞進行基因表達 量的全集成分析. 該研究組最近報道了利用電泳在 芯片上實現了基因沉默處理的細胞中的單細胞的基 因表達量的全集成分析. 該方法將單細胞捕獲、細胞裂解、cDNA 合成、親和富集、電泳檢測全部功能 集成在了一塊芯片上, 整個分析過程只需要 70 min 左右(圖 4). 集成在微腔中的微金“島嶼”通過寡核苷 酸的修飾和表面修飾有互補鏈的細胞相互作用, 由 于“島嶼”的面積(25 μmm二次方 )僅夠容納一個細胞, 所以每次分析嚴格地只分析一個單細胞. 細胞被捕獲后通 過裂解和逆轉錄合成 cDNA 片段, 在經過 30 次循環 的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR) 擴增后基因信號被顯著地放大, 集成在芯片管道上 的一段親和凝膠柱將待測基因片段進行有效的富集 之后通過電泳的分離檢測得到目標基因與對照基因 的相對表達量. 最終得到的基因沉默效率的結果與 常規大量細胞的分析結果有明顯不同, 在對單細胞 進行分析的結果顯示按沉默效率來分類細胞可以被 分為兩個大致的亞群, 基因沉默的效率分別為 100% 和 50%, 而這種細節信息在常規大體相群體細胞的 分析中被完全“遮蓋”了. 集成微流控芯片的作用的 優勢不僅在于實現了高通量的并行操作和把多步實 驗步驟自動化處理, 更重要的是, 它提供了可靠、高效 的新實驗方法, 而這樣的實驗, 利用傳統的分子生物 學實驗器材很難獲得可靠的結果.

染色質免疫沉淀的方法是經典的研究 DNA 與蛋 白相互作用的方法,可以精確地定位與蛋白結合的基 因位點. 傳統方法依賴于有經驗和技巧的實驗人員, 需要細胞量大(105 ~107 ), 單次實驗時間長(2~7 天). Quake 研究組[22]將這一方法在高度集成的微流控芯 片裝置上得以實現, 芯片中環形管道上的閥門既可 以獨立使用, 也可以配合使用形成蠕動泵. 對其精確 控制確保了每一步反應不被過量地稀釋以及反應的 充分與完全 (圖 5). 最終通過在芯片上的填充柱將 目標 DNA 片段捕獲和富集, 在芯片外完成定量 PCR 測定. 該方法克服了體相系統實驗中的許多局限性, 實驗僅需要 2000 個細胞就可以完成, 實驗過程中的 孵育時間由過夜縮短至 2 h, 整個實驗完成縮短至一 天之內, 并且自動化的芯片控制系統可以無需有經 驗的技術人員控制免疫沉淀實驗中的細節, 確保實驗的成功和平行性.

2006 年, Quake 小組利用集成微流控技術發展了針對單個細胞的 mRNA 富集和擴增芯片, 進行高 靈敏度的基因表達研究. 在常規方法中, 由于 mRNA 降解、非特異性吸附等問題的存在, 在mRNA 純化、 cDNA 合成過程中不可避免存在樣品殘留或損失問題, 因此要獲得可靠的實驗結果必須依賴于大量細 胞的分析. 而利用集成微流控芯片高通量和多功能 化的特點, 將單細胞捕獲、裂解、mRNA 純化、cDNA 合成以及 cDNA 純化五步反應整合在一塊芯片上,有效降低了樣品損失, 快速、高效地實現了對單細胞 中低拷貝數 mRNA 的分析研究. 同年, 哈佛大學 謝曉亮教授研究組利用β-半乳糖苷酶基因作為報告基因結合單分子熒光技術和微流控技術將單個的酵 母細胞封閉在微流控芯片的微培養腔室中, 研究了 單個細胞中蛋白表達的隨機性. 芯片為單個酵母細 胞提供了相對封閉的微環境, 使得β-半乳糖苷酶催 化生成的熒光產物即使很快地被泵出到細胞外也可 以在微腔室中積累到足以被檢測到的濃度. 最近, 謝曉亮研究組利用集成微流控芯片結合單分子熒光 顯微技術, 對培養于微管道中的大腸桿菌基因文庫進 行單分子 mRNA 和相應蛋白表達量的熒光標記和高通 量成像分析. 結果表明, 在任意給定的基因文庫中, 單個細胞內 mRNA 的表達水平與對應蛋白的表達水平沒有呈現相關性. 這種關聯性缺失的原因在于mRNA 與蛋白質在細胞內的壽命大不相同, 所以在 任意時刻, 單個細胞內的蛋白組和轉錄組是有顯著 區別的. 該研究為在單細胞單分子水平揭示蛋白組調 控和轉錄組調控的研究提供了新的平臺和思路(圖 6). PCR 方法是核酸研究的利器, 它能夠復制特定 的核酸序列, 使其不斷擴增. 這一方法已經廣泛應用 于生命科學的各個領域, 為其帶來革命性的變化. 但 常規 PCR 存在耗時長、操作繁瑣、試劑消耗量大等 缺點. 集成微流控芯片以其在微小體積下顯著改善 熱能傳輸、極大提高熱循環速度、降低昂貴試劑的消 耗等優勢, 為 PCR 操作的進一步優化提供了一條可 行的途徑 . 充分利用微流控芯片高通量的優勢, Mathies 研究組報道了功能高度集成化的芯片(圖 7(a),(b)), 在該芯片上可以完成對 RNA 的分析, 即可以將逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR), 擴增產 物的電泳分離和熒光檢測在同一張芯片上完成. 這 種芯片不僅高度集成化, 而且極大縮短分析時間(整 個過程可以在 45 min 內完成)、減少樣品消耗、避免 交互污染、提高檢測的靈敏度(RNA 分子的檢出下限 可達到 11 個拷貝), 從而可用于單細胞的基因表達分 析. 他們用該裝置檢測出了正常的乳腺組織和癌變的乳腺組織中 RNA 表達的不同.

圖 4 集成微流控芯片對單細胞中基因表達量的全集成分析過程示意圖[21] A~C: 單細胞被捕獲在微金“島嶼”上; D, E: 細胞被裂解, mRNA 逆轉錄合成 cDNA, PCR 擴增; F: 一段親和柱有效富集目標基因片段; G: 目標 基因片段電泳分離與檢測. 全過程在 80 min 之內完成

圖 5 集成微流控芯片對 2000 個左右細胞進行染色質免疫沉淀的研究[22] (a) 芯片設計結構示意圖, 4 個環形管路設計可以在一次實驗中對 4 組樣品平行測定; (b) 染色質免疫沉淀的基本過程示意圖

圖6 集成微流控芯片用于分析單個細胞中的單分子水平的 mRNA 和蛋白質表達[25] (a) 熒光標記的寡聚脫氧核糖標記單個 mRNA 分子, 黃色熒光蛋白融合的基因標記表達后的蛋白分子; (b) 芯片俯視圖和實驗裝置示意圖; (c) YFP 在細胞中的表達, 顯示出被轉錄和翻譯的基因; 與該基因對應的 mRNA 被轉錄; (d) 在某時刻時的 mRNA 轉錄水平和對應基因的蛋白 質被翻譯水平關系圖, 表明在該時刻轉錄水平和翻譯水平之間沒有顯著的相關性

微流控技術還可以用于 DNA 的富集和擴增. 在 微流控芯片內進行基因擴增, 特別是針對單個細胞 的基因型分析和測序樣品準備上, 和傳統方法相比, 具有單個實驗用量小(納升甚至皮升)、利于高通量集 成、便于控制平行實驗條件等優點. Quake 小組開發的數位化 PCR 芯片(圖 7(c),(d))集成了大量納升微 反應室, 當含有目的基因序列的樣品被適當稀釋后, 目的基因拷貝數在反應室中的分布符合泊松分布規 律. 經過 PCR 過程, 最后觀察反應室中產物的有無, 即可通過計數反推得到目的基因的拷貝數. 他們通 過從環境土壤中分離無法進行實驗室培養的微生物 種群, 擴增并分析了參與白蟻及其共生體系中的關 鍵酶的編碼基因, 發現了未知的以核糖體 RNA 為基 礎的共生生物物種[28]. 這一方法還被成功運用于產 前診斷中, 通過對母親外周血內來自胎兒的游離 DNA 的測量進行產前染色體畸變疾病的篩查[29,30]. 這樣的裝置, 在對單細胞檢測有重要需求的干細胞 研究和測序研究可以大大提高效率、減少實驗的成本 并減小實驗誤差, 利用大規模集成的數位化PCR微流控芯片來進行基因組測序樣本的質量控制, 已經取得了很好的效果, 為測序實驗的成功提供了保證.

圖 7 集成微流控芯片用于聚合酶鏈式反應(PCR)應用實例 (a) 多通道 RT-PCR-CE 芯片結構示意圖, 在 1 塊 100 mm 直徑的芯片上集成有阻抗加熱元件、加熱電極引出條、Ti/Pt 感應溫度傳感器、PCR 反應腔室、電泳分離通道和 PDMS 氣動微閥; (b) 反應腔室區域放大圖[26]; (c) 數位式集成化 PCR 微流控芯片示意圖, 深色, 反應微腔室; 淺色, 微閥; (d) 數位式集成 PCR 反應結果圖

傳統的核酸微陣列芯片依賴于高通量的自動點樣系統, 溶液的體積通常在微升級別; 有些其他方法, 如超聲聚焦和壓電噴液等, 可以實現皮升級別的液 體自動分配和點樣, 但是通量較低且商品化儀器價格昂貴. 我們開發了一種全新的高通量開放式納升 級液體點樣芯片(圖 8). 該芯片通過氣壓推動液體 在微管道中流動, 液滴進而由開放式出口擠出, 通過 編程控制各個液滴可尋址性的進入玻璃芯片上對應 位置的微孔. 定量 PCR 結果證實了該芯片的高度并 行性、重復性和可控性. 便捷的操作和開放式接口的 設計, 使該芯片在高通量核酸定量分析、高通量藥物篩選等領域具有廣闊的應用前景.

圖 8 微流控微分配裝置示意圖 微分配芯片在精密步進電機的帶動下配合下方微池芯片實現高通量 的自動化溶液分配

在免疫分析中最為人們所熟悉的檢測手段之一 就是 ELISA(酶聯免疫檢測), 傳統方法在操作過程中 需要受過專門訓練的技術人員進行操作而且費時費 力, 為一些重要疾病的診斷與治療監測帶來麻煩. 利 用集成微流控芯片的優勢有望實現自動化且方便的 ELISA 檢測. 在相對復雜的集成微流控芯片操作中, 控制流體的運動是關鍵, 巧妙地驅動液體運動可以 大大簡化芯片的使用難度. Lai等人[32]報道了一種 CD 光盤式的用來進行酶聯免疫分析(ELISA)的微流控操 作平臺. 整個微流控操作平臺建立在一張塑料圓盤 上, 像 CD 唱機旋轉唱片一樣旋轉圓盤, 利用離心力 和毛細管力來驅動反應中涉及到的溶液, 酶聯免疫 分析的每一步反應的進樣靠控制圓盤的旋轉速度來 自動控制. 他們用該種裝置來進行雜交瘤細胞中鼠 的 IgG 分析, 結果顯示, 與傳統的 96 孔板的分析相比, 該方法具有相同的檢測范圍但卻消耗更少的試 劑和更短的時間, 滿足了醫學診斷的需求.

規模集成化微流控芯片裝置不僅可以在微尺度 上實現常規生物學方法建立起來的檢測體系和技術, 而且可以實現很多常規手段和技術難以實現和達到 的研究. 比如：基因的表達與調控是生物學研究的核 心問題之一, 不同水平的基因調控都涉及到特定蛋 白因子之間或蛋白因子與 DNA 或 RNA 之間的弱相 互作用, 傳統方法缺乏實現對弱相互作用進行高通 量研究的手段. Quake 實驗室[33]利用機械力限制捕獲 的方法展示了一種高通量微流控芯片平臺, 用于測 定轉錄因子的結合能譜. 該芯片將氣動微閥設計成 了紐扣形狀, 在下壓關閉時可以與下底面的位點直 接接觸而保留受較弱相互作用而結合的分子. 基于 此設計該研究組實現了對真核細胞轉錄因子與 DNA 之間結合能譜的描繪(圖 9(a)). 該方法可以實現不同 轉錄因子與 DNA 結合能測量的高通量與并行化, 為 理解體內真核細胞轉錄因子參與基因的表達與調控 提供了可參照的技術平臺. 同樣利用該機械力限制 捕獲的設計, Quake 實驗室在集成化的微流控芯片 平臺上結合蛋白體外翻譯系統實現了對肺炎鏈球菌 43 個蛋白之間相互作用的研究. 在兩個相鄰的微腔 室中, 各自在基底上采用核酸和蛋白的點樣, 其中一 個微管道中集成有紐扣式下壓微閥作為機械限制力, 在蛋白相互作用之后可以保留蛋白之間的弱相互作 用力和測定蛋白之間的親和作用(圖 9(b)). 該項研究 發現了很多肺炎鏈球菌中新的蛋白相互作用對, 驗 證了反饋調節在代謝調節中的普遍機制, 并且證實 某些蛋白在調節中扮演了多重調節角色.

Ｘ射線衍射法是研究蛋白質分子三維結構的主 要研究手段, 如何快速得到高質量蛋白質晶體成為 結構生物學發展的瓶頸. 高度集成化的微流控芯片 為蛋白質結晶條件的高通量、快速篩選提供了一個很 好的平臺. 并且在微流體系的微小尺度下, 因密度差 異導致的自然對流可以忽略不計而自由擴散成為物 質交換的主導因素, 為蛋白質結晶提供了一個非常 有利的動力學環境. Quake 實驗室[35]在大規模集成微 流控芯片制作的基礎上通過一系列微泵和微閥的集 成構建了可以實現多種溶液方便定量混合與操縱的 芯片, 成為“自動化配方”式微流控芯片裝置, 應用該 芯片研究了木聚糖酶在不同沉淀劑配方條件下的晶 相變化. 該方法較之傳統方法的結晶篩選效率提高了 72 倍(圖 10(a)). 這一方法及之后的改進與發展 已經成功運用于結構生物學的研究中, 提高了獲取 晶體的成功率并節省了人力資源的消耗. Ismagilov 實驗室利用油相將含有不同種類、濃度配比的蛋白 質、沉淀劑和鹽溶液的水相分散成一個個獨立的液體, 進行蛋白質結晶條件的高通量篩選, 并且該方法生成的蛋白質結晶產物可以保存在毛細管內直接進行 原位Ｘ射線衍射分析(圖 10(b)). 在相似的液滴芯片中, 該實驗室還利用蒸發擴散的原理, 使水分子在 滲透壓的作用下從低鹽濃度的蛋白質結晶液滴中擴 散到高鹽濃度的溶液液滴中, 從而使結晶液滴中蛋白質濃度逐漸升高達到飽和, 進而形成結晶. 最近, 該實驗室利用自由界面擴散和“滑動”芯片技術設 計了可以進行大規模蛋白結晶條件篩選的實驗[38]. 用 芯片上下兩層之間的相互滑動控制可以實現預先分隔 開來的蛋白溶液和沉淀劑通過自由界面擴散混合, 大 規模的集成可以進行多個蛋白樣品的平行實驗和多個 條件的篩選. 該技術在芯片的設計上巧妙地利用了輸 送液體管道的寬度變化實現了同一條件下的不同反應 平衡時間的選擇(圖 11), 為了解決在滑動過程中有可 能產生的溶液滲漏問題, 他們在芯片的平面上蝕刻了 納米尺度的點陣列, 使得表面的疏水性大大提高, 這 樣就限制了溶液從管道和儲液池滲透出來. 最終在 3 塊芯片上實現了的 480 個獨立的條件實驗, 每個蛋白 樣品僅消耗了 12 mL, 在芯片上成功結晶了烯酯酰輔 酶 A 水合酶和四氫葉酸還原酶. 這類“滑動”芯片雖然 在結構集成上比較簡單, 但是在操作上集成了機械運 動, 大大拓展了芯片的使用范圍, 值得關注.

圖 9 高通量集成微流控芯片中利用機械力限制捕獲弱相互作用保留測定和繪制轉錄因子和蛋白相互作用譜圖 (a) 集成 2400 反應腔室和 7233 個微閥的芯片示意圖, 測定轉錄因子與目標 DNA 結合作用力的測定過程; (b), (c) 利用體外蛋白翻譯系統結 合芯片中限制捕獲弱相互作用保留研究蛋白間相互作用芯片示意圖和實際測定中的熒光照片

圖10 集成微流控芯片中研究蛋白質結晶條件的高通量篩選 (a) “自動化配方”式微流控芯片裝置結構示意圖與芯片實物圖, 微閥 與微泵的配合形成定量式的微注射于微混合器, 定量控制不同溶劑 與沉淀劑所占的比例; (b) 利用集成微流控芯片微液滴技術研究不同條件下膜蛋白的單晶形成和分子結構

圖 11 滑動微流控芯片進行蛋白結晶條件篩選實驗[38] (a) 芯片實驗過程示意圖; (b) 不同管道構型和尺寸在實驗過程中控制蛋白結晶反應平衡時間實驗照片

以上實例均反映了集成微流控芯片在生物大分子研究中的獨特作用. 現代分子生物學的實驗通量越來越高、單個實驗可以提供的樣品量越來越少、高 精度的重復勞動所占比例逐漸增加, 這些都意味著 集成微流控芯片有望成為下一代的試管和多孔板, 成為分子生物學實驗的常規方法. 在實現這個目標 之前, 還有一些困難需要被克服: (1) PDMS 材料雖然大量被使用, 但是其表面容易吸附蛋白質分子, 對某 些實驗會帶來影響, 如何對 PDMS 表面進行改性, 或 者使用其他材料使其不容易吸附生物大分子, 是一 個重要問題; (2) 芯片實驗往往針對特定的實驗需要 進行芯片的設計, 分子生物學實驗的步驟和試劑多 變, 如何能夠設計一些通用性強的芯片, 可以很容易 的被生物學家們熱愛并使用, 是一個亟需解決的問 題; (3) 如何在不斷簡化操作與設計的同時, 增加芯片處理的通量, 將符合后基因組時代利用微量樣品 進行超大規模實驗的需求.

2.3 芯片上的化學合成

傳統的化學合成通常在燒瓶, 燒杯等大體積的 容器中進行, 為了獲得更快的熱傳導、物質擴散和反應過程, 進一步提高反應的選擇性, 人們開始關注在 微反應器中進行化學合成, 而這種微量的化學合成 與生物醫學的需求正好吻合. 例如在核醫學影像檢查中, 一個重要的技術是正電子發射計算機斷層掃描(positron emission computerized tomography, PET), 該方法中常用的一個示蹤物質 2-18 氟-2-脫氧葡萄糖 (2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose, [18F]FDG)的常規合 成需要訓練有素的工作人員使用放射性藥物合成的 特殊設備, 花費幾十分鐘的工作時間. 18-氟的半衰 期卻只有 110 min, 反應過程不得不花費的時間為該 技術的臨床應用帶來了一些局限性, 例如需要加大 放射性原材料的劑量和使用更大規模的設備等等. Quake 研究組和加州大學洛杉磯分校的放射藥物學 家合作, 利用合理設計的微閥與微泵, 將[ 18F]FDG 合 成中的氟化物富集、脫水、標記、脫乙腈、水解五步 反應高度集成在微流控芯片上(圖 12(a)), 使[ 18F]FDG 合成全過程縮短至 14 min, 并將合成產物直接注射 入小鼠體內, 利用 PET 得到腫瘤分布的清晰圖像. 這一實驗表明, 在芯片上實現化學合成并非只是簡單地在小體積反應器內重現反應過程, 而是可以帶來更多的優勢.

由美國諾貝爾化學獎獲得者夏普利斯(K. Barry Sharpless) 實驗室發展出一項名為點擊化學 (click chemistry)的新合成方法成為化學合成與藥物發現領 域的重要耦聯技術之一, 通過該方法能夠產生一系列 高立體選擇性的產物, 且其副產物無害. 反應本身對 氧氣和水不敏感, 具有高效率和高控制性的特點. 將 這項技術與集高通量、高度自動控制等特點于一身的 集成微流控芯片結合, 美國加州大學洛杉磯分校的曾 憲榮研究組選擇經典的 bCAII 點擊化學體系, 在一塊 芯片上驗證了同時進行 32 個同位點擊化學反應的高 效性和穩定性, 并且極大的減少了珍貴樣品如蛋白質 的消耗. 這一成功范例展示了微流控芯片在高通量 合成、篩選新型藥物產業中的潛力, 使得原先費時、 費力、費錢的規模化合成實驗以全新的方式來實現.

2007 年, Quake 實驗室[41]報道了利用全氟聚醚 (PFPE)材料通過集成微流控芯片實現高質量核酸合 成的結果(圖 12(b)). 在合成過程中, 需要使用到二氯 甲烷等對 PDMS 材料有強溶脹能力的有機溶劑, 而 PFPE 材料對絕大多數有機溶劑具有很好的抵抗能力, 同時其力學行為和 PDMS 接近, 具有很好的彈性, 可 以利用多層鍵合的方式加工集成微流控芯片, 文章 以 DNA 合成為例, 演示了集成微流控芯片在多步復 雜有機合成中的潛在用途. 芯片上 DNA 分子的合成 和傳統方法相比沒有本質的區別, 因其具有樣品低 消耗的優勢, 他們采用(1S)-(+)-(10-camphorsulf onyl)oxaziridine(CSO)作為氧化劑替代傳統實驗中使 用的廉價碘劑, 進一步提高合成的準確性. 利用化學 方法合成寡聚核酸分子, 是現代生物學實驗的重要 依托手段之一. 傳統的方法是采用商品化的核酸合 成儀通過設定不同的核苷按照一定次序逐步加成來 實現的. 這一方法發展到現在已經非常成熟了, 采取 固相有機合成技術, 每一個核苷的加成一共經歷了 去保護、加成、氧化、封閉等 4 個化學反應步驟, 4 個步驟完成一次的總產率一般都可以保持在 99%以 上. 在集成微流控芯片內合成的寡聚 DNA 分子在分 子生物學的研究中具有重要的應用價值, 首先產物 的量大小合適, 在 pmol 量級, 特別適用于大部分分 子生物學實驗, 大大減少了原料的浪費和廢液廢料 的產生; 其次, 通過合理的布局, 可以實現核酸文庫 的合成, 這對于高通量的生物學研究具有重要輔助 意義. 最近, Quake 實驗室在 PDMS 上對上述合成 方法進行了推廣, 在一塊芯片上同時進行 16 個寡聚核酸序列的合成, 并通過連接酶將其拼裝成一段基 因. 這一技術對于合成生物學的發展將帶來重要的 技術支持, 利用微流控芯片進行高通量 DNA 合成將 是這個領域的發展趨勢.

圖 12 集成微流控芯片用于化學合成的研究 (a) 規模集成式芯片用于操控液體在芯片中合成 2-18 氟-2-脫氧葡萄糖芯片核心結構與過程示意圖[39]; (b) 用于合成寡聚核苷酸分子的集成式 PFPE 微流控芯片實物圖

集成微流控芯片進入合成化學領域, 并不能取代現有的絕大多數有機合成所使用的容器和方法. 芯片上的合成化學必須適合于這個特殊的體系, 并可以利用這個體系帶來其他傳統體系無法提供的便捷或效率. 在組合化學、有機合成方法學、生物無機化學、化學生物學、核酸化學等相關的領域, 由于其 受到現有手段的很多制約, 是利用集成微流控芯片 尋找突破口的最好切入點.

集成微流控芯片已經成為深入分離分析、化學合 成、藥物微分析系統、分子免疫學、快速診斷系統、 分子生物學、細胞生物學、神經生物學、系統生物學、 結構生物學、組織生物學、微生物學等一系列應用研究領域的綜合性、多學科、多領域的交叉學科研究熱 點. 大規模集成型芯片不僅可以實現許多化學和一 些傳統生物學實驗的自動化操作、檢測與分析, 而且可以大大減小樣品、試劑和時間的消耗, 極大地提高 實驗的通量, 減少實驗中廢棄物的產生. 更重要的是,集成微流控芯片不僅僅是簡單地對傳統意義上的化 學或生物學實驗進行微型化的集成, 它提供了一種 全新的理念和技術平臺, 使得原先在傳統的化學和 生物學手段下很難完成或不能完成的某些實驗能夠得以順利地實現.

（文章來源：科學通報，2011 第56卷 第23期：1855~1870 轉載僅為傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除）