核酸體外擴增技術在分子生物和生物分析等領 域是一項重要的技術，可用于定性、定量地分析和 檢測微量核酸，其在臨床醫學、檢驗醫學、分子生物學、基因組學及食品安全等相關的各個領域發揮 著重要的作用，是生命科學發展不可或缺的一種重 要檢驗方法。隨著生物技術在臨床和現場檢測方面 要求的不斷提升，越來越多的研究人員開始把目光專注于核酸體外擴增新技術的研究。聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）由于其特異性強，靈敏度高等優點，是目前應用最為廣泛的核酸體外擴增技術。

聚合酶鏈式反應

雖然 PCR 技術已經應用于分子生物 學等各個領域，但是該技術需要通過不斷的變化溫度才能實現核酸擴增，因此，熱循環儀是不可或缺 的設備。然而，由于熱循環儀體積大、價格較高， 使其在基層的推廣和現場檢測受到了極大的限制。因此，陸續出現了不同的等溫擴增技術，這些技術反應溫度單一，不受熱循環儀的制約，正逐漸成為 PCR 的最佳替代方法。

20 世紀 90 年代初，很多研究人員看到了突破 傳統核酸體外擴增技術將會帶來核酸體外擴增的新 革命，從而嘗試創新發展無須熱變性的核酸恒溫擴 增技術，并挖掘其在各領域應用的潛力，這些核酸 等溫擴增的新技術應用于生命科學及相關的各個領 域是必然趨勢，也吸引了越來越多研究者的目光。

 等溫擴增技術的基本原理和反應成分各不相同， 依據等溫擴增的基本原理和步驟，本文將現有等溫 擴增總結為兩大類，第一類是第一步反應依賴于特 異性引物延伸的等溫擴增技術 ；第二類是第一步反 應依賴于限制性內切酶的等溫擴增技術。本文概述 并比較分析了核酸等溫擴增技術的優缺點及反應原 理等，以期對相關領域的研究起到積極的促進作用。 1 依賴于特異性引物延伸的等溫擴增技術 與傳統 PCR 技術相似，為了保證目的片段特異 性擴增，避免非特異產物的形成，在眾多等溫擴增 方法中，依然使用特異性引物退火延伸作為等溫擴 增的起始步驟，如依賴核酸序列擴增技術、滾環擴 增技術、環介導等溫擴增等。但是，由于引物與目 的模板退火結合的機理，這就不可避免地要對非單 鏈的起始靶物質進行高溫變性處理，這些方法并不 是徹底的等溫擴增。隨著技術的發展，為了避免高 溫熱變性步驟，DNA 解旋酶、單鏈結合蛋白等被引 入等溫擴增體系。

1 依賴于特異性引物延伸的等溫擴增技術

 與傳統 PCR 技術相似，為了保證目的片段特異 性擴增，避免非特異產物的形成，在眾多等溫擴增 方法中，依然使用特異性引物退火延伸作為等溫擴 增的起始步驟，如依賴核酸序列擴增技術、滾環擴 增技術、環介導等溫擴增等。但是，由于引物與目 的模板退火結合的機理，這就不可避免地要對非單 鏈的起始靶物質進行高溫變性處理，這些方法并不 是徹底的等溫擴增。隨著技術的發展，為了避免高 溫熱變性步驟，DNA 解旋酶、單鏈結合蛋白等被引 入等溫擴增體系。

1.1依賴核酸序列擴增技術

依賴核酸序列擴增技術（Nucleic acid sequencebased amplification，NASBA） 于 1991 年 由 Compton 等首次提出，該方法結合了轉錄依賴擴增系統 （Transcription-based amplification system，TAS）和 自 主 序 列 復 制 系 統（Self-sustained sequence replication，3SR）2 種方法，并對其進行改進。

NASBA 技 術 與 3SR 相 似， 依 賴 AMV 逆 轉 錄 酶、RNase H 和 T7 RNA 聚合酶和一對引物來完成等 溫擴增，整個反應包含非循環相和循環相。在對目 的 RNA 片段進行擴增時，以指數擴增方式大量生成 單鏈 RNA。不過，與 3SR 相比，NASBA 使用了 DMSO（ 二 甲 基 亞 砜，Dimethyl sulfoxide，DMSO）， 反應溫度也適當地從 37℃提高到 41℃，有效地提 高了反應的特異性。隨后，Gene-Probe 公司基于 NASBA 成功研制出依賴轉錄介導擴增（Transcription mediated amplification，TMA）檢測試劑盒，帶有 RNase H 活性和逆轉錄酶活性的 MMLV 逆轉錄酶（鼠 白血病逆轉錄酶）取代了 AMV 逆轉錄酶、RNase H。 由于 3SR，NASBA 和 TMA 的原理十分相似，所以 較多文獻將這 3 種技術或其中兩種視為同一種。

NASBA 除了應用于 RNA 擴增，經過適當的改 良也可以擴增 DNA：一種方法是使用限制性內 切酶切割雙鏈 DNA，使其末端產生 T7 RNA 聚合酶 啟動子序列；另一種方法是在非循環相里進行兩 次 95℃變性，第一次變性，雙鏈 DNA 解離成單鏈 DNA，引物退火結合上后，在 AMV 反轉錄酶的作用 下，延伸形成新的雙鏈 DNA，接下來進行第二次變 性，從而獲得了 5' 端含有 T7 RNA 聚合酶啟動子序 列的單鏈 DNA。

NASBA 由于其快速高效、操作簡便、設備要 求低、擴增對象廣等特點，已被廣泛應用與發展。 Lau 等分別使用 NASBA- 電化學發光法（NASBAECL）和 NASBA- 酶連接寡核苷酸捕獲技術（NASBAEOC）兩種檢測方法檢測出口蹄疫病毒 ；Zhao 等 通過微流控芯片實時免疫 NASBA 檢測出水傳染病原 菌 ；Clancy 等開發出一種帶有擴增內標的雙重 實時 NASBA 診斷方法，成功檢測引起細菌性腦膜 炎的流感嗜血桿菌，腦膜炎奈瑟氏菌和腦炎鏈球菌。 H?nsvall 等使用實時 NASBA 技術擴增微小隱孢 子蟲和人隱孢子蟲的 MIC1 轉錄本，成功區分以上 兩種隱孢子蟲，在 10 μL 保存懸液中，檢測靈敏度 可低至 5 個隱孢子蟲卵囊。Zeng 等結合 NASBA 和 ELISA 兩種技術優勢，開發出 NASBA-ELISA 檢 測方法，實現高效簡便檢測草魚呼腸孤病毒。盡管 NASBA 存在眾多優勢，但是其缺點也不能被忽視 ： 首先，其不是完全意義上的等溫擴增技術，不能進 行一步擴增 ；其次，酶的熱穩定性差，不能在反應 之前加入 ；最后，有效擴增片段的長度較短，僅100-250 bp 之間。

1.2 滾環擴增技術

Fire 等 于 1995 年首次提出滾環擴增技術 （Rolling circle amplification，RCA），該技術是借鑒微 生物環狀 DNA 復制過程建立起來的一種體外等溫擴 增技術。在 RCA 反應中，phi29 DNA 聚合酶是至關 重要的組成部分，具有持續 DNA 合成能力和鏈置換 活性。RCA 的反應模板通常是單鏈環狀 DNA，因此， 須對雙鏈 DNA 樣品進行處理。如果樣品是雙鏈環 狀 DNA，則變性處理即可 ；但如果樣品是雙鏈線狀 DNA，在進行變性處理后，還需用 T4 多核苷酸激酶 與 T4 DNA 連接酶環化單鏈線狀 DNA。RCA 按 引物數量可分為單引物 RCA，雙引物 RCA 和多引物 RCA。

1.2.1 單引物 RCA 只需要一條引物 P1 即可完成 擴增。引物 P1 與單鏈環狀 DNA 結合后，在 phi29 DNA 聚合酶的作用下開始延伸，當合成至自身 5' 端 時，在 phi29 DNA 聚合酶鏈置換活性的作用下，5' 端 DNA 開始被置換下來，并繼續以環狀 DNA 為模 板進行線性合成，最終生成一條具有重復序列且與 模板 DNA 完全互補的線狀單鏈 DNA。

1.2.2 雙引物 RCA 也稱為超分支滾環擴增，在 單引物 RCA 的基礎上，再增加一條與擴增產物互補 的引物 P2，P2 可與單引物 RCA 的產物退火延伸。 隨著反應的進行，P2 延伸鏈開始將下游 P2 的延伸 鏈置換下來，被置換下來的 P2 延伸鏈作為模板與 P1 結合。同樣地，上游 P1 延伸鏈會把下游 P1 延伸 鏈置換下來，如此形成指數擴增，最終得到一系列 長短不一的雙鏈 DNA 產物。

1.2.3 多引物 RCA由 phi29 DNA 聚合酶、單鏈 環狀 DNA 模板和隨機引物組成。多引物 RCA 原理 與雙引物 RCA 相似，隨機引物可以在環狀 DNA 的 不同位置同時延伸產生多個復制叉，然后在聚合酶 的作用下置換非模板鏈，在置換非模板鏈的同時， 其他隨機引物也開始與非模板鏈退火延伸，進而合 成雙鏈 DNA。與單引物 RCA 和雙引物 RCA 相 比，多引物 RCA 在合成速率和產量方面得到了明顯 提高。

到目前為止，出現了許多原理與 RCA 相似或衍 生于 RCA 的核酸擴增技術，如利用 T7 RNA 聚合酶 建立的以單鏈環狀 DNA 為模板的滾環擴增技術 ； 用于擴增基因組 DNA 的多重置換擴增技術（Multiple displacement amplification，MDA）；利 用 鎖 式探針的信號擴增 RCA。在微生物檢測方面， Rockett 等開發出依賴特異性引物的 dRCA 技術， 在存在人源 DNA 的情況下，成功特異擴增 BKV， HPyV6，HPyV7，TSPyV 和 STLPyV 等 7 種人多瘤病 毒，相比使用隨機引物的傳統 RCA 法，dRCA 具有 更強的靈敏度和更高的產量。Wen 等使用 RCA 技術擴增埃博拉病毒基因，同時基于氧化石墨烯吸 附 FAM 的性質，開發出一款新型熒光生物傳感器， 成功對擴增產物進行檢測，檢出限低至 1.4 pM，即 使在 1% 人血清中，也可檢測出目的基因。Hao 等 基于 RCA 技術和 WS2 納米片，發明了一種用于檢測 金黃色葡萄球菌的加強化學發光能量共振轉移傳感 器，其檢出限可達 15 CFU/mL。RCA 與其他核酸擴 增方法相比，其主要優點為 ：反應機制簡單，僅需 一種聚合酶即可實現核酸擴增 ；靈敏度高，一條引 物可達到 105 倍擴增，而兩條引物的擴增效率可 達到 109 倍；不需要 PCR 儀，避免了熱循環過程 對反應組分的影響。RCA 的不足之處在于 ：前期處 理繁瑣，反應模板要求是單鏈環狀 DNA，須對不符 合要求的樣品進行退火和環化處理 ；反應時間較長， 至少需要 4 h。

1.3 環介導等溫擴增

環 介 導 等 溫 擴 增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是 Notomi 等 于 2000 年開 發的一種具有快速高效、特異性強、錄敏度高等特 點的等溫擴增技術。LAMP 的反應過程可分為 3 個 階段 ：循環模板合成階段、循環擴增階段和伸長再 循環階段。LAMP 使用 4 條引物，分別是正向 內引物 FIP（包括 F1c 和 F2 兩部分序列，其中 c 代 表反向互補序列），反向內引物 BIP（包括 B1c 和 B2），正向外引物 F3 和反向外引物 B3。

反應初始，FIP 和 F3 先后與單鏈 DNA 模板結 合，引發循環模板合成，隨著 F3 的延伸，FIP 產生 的延伸鏈被置換出來，同時，其 5' 端發生自我堿基 52 生物技術通報 Biotechnology Bulletin 2017,Vol.33,No.7 配對，形成環狀結構。隨即，BIP 和 B3 以環狀結構 DNA 作為模板延伸，引發新一輪鏈置換反應，最終 形成一條啞鈴狀單鏈 DNA，即循環模板。進入循環 擴增階段后，啞鈴狀單鏈 DNA 3' 端以自身為模板 進行延伸，打開 5' 端環狀結構，形成一條雙鏈莖環 DNA。隨后，FIP 的 F2 區域與莖環 DNA 環狀結構 中的 F2c 區域互補配對，發生延伸置換反應，自此 引發循環擴增和伸長再循環擴增，進入指數擴增階 段。隨著 FIP 與 BIP 不斷與環狀結構結合，鏈置換 反應持續發生，最終大量生成不同長度地多環花椰 菜結構 DNA，而每條 DNA 則是由交替反向重復靶 序列構成。LAMP 原理雖然復雜，但是實際操 作簡單，是一種簡單、快速、有效的核酸擴增技術。

LAMP 的主要優點是特異性強，多條互補序列 的引入使得即使存在非目的 DNA 的情況下，也不會 對靶序列的擴增產生明顯影響 ；其次，LAMP 擴增 效率高，由于存在多個循環體系，可實現高效擴增， 其檢測限可低至幾個拷貝，遠優于 PCR。再次， LAMP 擴增產物檢測方便，LAMP 會產生焦磷酸鎂白 色沉淀，通過肉眼或濁度儀即可判定體系是否發生 DNA 擴增，適合用于即時檢測（Point-of-care testing， POTC）。在 10 多年的時間里，不斷有研究者從模板性質、反應抑制因子、環引物的引入及多 重檢測等方面對 LAMP 進行改進。到目前為止， 由于引物設計的復雜性，僅發展到五重檢測。由于 LAMP 反應成本低、擴增時間短，無論是實驗室研 究還是現場檢測都可以準確、快速、靈敏的完成， 所以在基層檢驗的推廣中具有良好的前景，是真正 普及型的核酸檢測方法。科學家們已經將 LAMP 技 術成功應用于病毒、致病菌及轉基因作物的檢測。盡管 LAMP 擴增技術應用十分廣泛，但是不 可避免的，LAMP 也存在一定的缺陷 ：首先，由于 LAMP 產物鑒定結果只有擴增與不擴增，所以如果 發生非特異性擴增，則不易識別。其次，其基本原 理是基于鏈置換和鏈取代兩種過程，LAMP 的擴增 片段長度一般在 200-300 bp，限制了 LAMP 在擴增 長片段方面的應用。另外，由于高靈敏度，操作過 程中極易發生污染從而產生假陽性結果 ；LAMP 在 產物的回收、鑒定、克隆和單鏈分離等方面也存在 很大的操作障礙。 1.4 依賴解旋酶擴增技術 DNA 體內復制主要依賴于 DNA 解旋酶、DNA 聚合酶以及各種輔助因子，根據以上復制機制， Vincent 等模擬出依賴解旋酶擴增技術（Helicasedependent amplification，HDA）。HDA 是 一 種 徹 底 的等溫 DNA 體外擴增技術，目前，能夠達到反應 全過程恒溫這一條件的體外等溫擴增技術屈指可 數，其全程等溫的實現主要依賴于大腸桿菌 UvrD 解 旋酶。

HDA 的原理分為兩個階段 ：第一階段，核酸解 旋酶打開 DNA 雙鏈，使目的模板鏈解鏈為單鏈狀態； 單鏈結合蛋白與之結合，它的作用是保證單鏈結構 不發生復性 ；第二階段，DNA 聚合酶各自以單鏈為 模板由引物為起始生成新鏈，新生成的雙鏈 DNA 作為下一輪擴增的模板，如此反復循環擴增實現靶 DNA 量的指數增加。HDA 的反應步驟與 PCR 相似， 均包括雙鏈 DNA 解鏈、退火及延伸等步驟，但最大 的區別是采用酶維持單鏈作用替代升溫解雙鏈過程。 HDA 的出現引起了許多研究者的關注，并對 其進行了大量的研究及改進。An 等報道了嗜熱 HDA（Thermophilic helicase-dependent amplification， tHDA），該技術將原先使用的大腸桿菌 UvrD 換成了 來自騰沖嗜熱桿菌 Thermoanaerobacter tengcongensis 的耐熱 UvrD 解旋酶（Tte-UvrD）。該酶的應用使反 應可在 60-65℃之間進行，溫度的提升增強了該技 術的靈敏度和特異性。Li 等 在未提取 DNA 的 前提下，直接使用 tHDA 成功檢測出人體血液中的 瘧原蟲，檢出限達到 50 拷貝。Motré 等研發出 了一種具有兩種不同功能的新酶，既可以解旋雙鏈 DNA，又可以進行聚合反應，解決了解旋酶與聚合 酶協作效率低的問題。這種酶實質上是 Tte-UvrD 和 Bst DNA 聚合酶通過卷曲螺旋域連接在一起的復合 體。該新酶的使用明顯提高了擴增片段的長度。除 了 前 面 提 到 的 兩 種 發 展 外，Xu 等 的 cHDA 和 Goldmeyer 等的 RT-tHDA 也對傳統 HDA 進行了 改良。

HDA 作為新型等溫核酸擴增技術的優勢在于 ： 反應全程溫度恒定，無需調節溫度，克服了傳統 2017,33(7) 王大洲等 ：核酸等溫擴增技術在微生物快速檢測中的研究進展 53 PCR 通過“變性 - 退火 - 延伸”過程的多次變溫循 環的瓶頸 ；反應機制簡單，僅需兩條簡單的引物 ； 反應時間較短，在 1-1.5 h 就可以實現擴增。然而 HDA 也存在其缺陷，目前，常用的解旋酶是大腸桿 菌 MvrD 解旋酶，其解鏈速度為 20 bp/s，解旋速度 慢及持續能力差，因此 HDA 只適用于擴增短片段。

1.5 重組酶聚合酶擴增

繼 HDA 之 后，Piepenburg 等 于 2006 年 創 建了一種新型的全程等溫擴增技術，其與 HDA 相 似，也使用酶來打開雙鏈 DNA，該技術稱為重組酶 聚 合 酶 擴 增（Recombinase polymerase amplification， RPA）。RPA 是參照了 T4 噬菌體 DNA 復制系統，該 反應系統中除了需要一種常溫下能工作的 DNA 聚合 酶外，還包含噬菌體 μvsX 重組酶和單鏈 DNA 結合 酶 gp32，目前有些實驗中還會加入輔助 μvsX 重組 酶的 μvsY 蛋白。重 組 酶 介 導 等 溫 擴 增（Recombinase aid amplification，RAA） 是 基 于 RPA 的 一 種 改 良， 最 大的突破是重組酶的選擇上。RPA 使用的是噬菌 體 μvsX 重組酶，而 RAA 使用的是從細菌或真菌中 獲得的重組酶。這類酶不僅來源更為廣泛，而且最 重要的是它在 37℃恒溫下便可與引物緊密結合形成 酶 - 引物聚合體，反應的溫度適應性更強。

兩種方法的擴增原理為 ：引物常溫條件下與重 組酶結合形成一種結構穩定的復合物，當引物在模 板 DNA 上搜索到與之完全互補的序列時發生退火 ； 退火發生的同時單鏈 DNA 結合蛋白被激發，發生 作用使模板 DNA 保持單鏈狀態，引物在 DNA 聚合 酶催化作用下延伸形成新的 DNA 互補鏈。RAA 和 RPA 反應迅速快捷，通常在 1 h 內即能得到可以用 瓊脂糖凝膠電泳檢測到的擴增產量。

與 HDA 相 同， 用 于 檢 測 PCR 產 物 的 方 法 也 可用于 RPA。Piepenburg 等設計了含有一個四氫呋 喃（Tetrahydrofuran，THF）分子的熒光探針，并在 THF 兩側的核苷酸上分別標記一個報告熒光基團和 一個淬滅熒光基團。同時，為了防止探針被作為引 物延伸，對其 3' 端進行修飾。當探針結合到模板 上時，來自大腸桿菌的核酸內切酶 IV（Nfo）識別 切割 THF，上游探針形成新的 3' 端，在 Bsu 聚合 酶的作用下，作為引物延伸，置換出下游探針，從 而使兩個熒光基團分離，產生熒光信號。為了實現 無需實驗室的即時檢測，Piepenburg 等還設計了用 于側向流試紙條檢測的探針。該探針與熒光探針相 似，其正向引物標記羧基熒光素（Carboxyfluorescein， FAM），反向引物標記生物素，因此，在 Nfo 和 Bsu 聚合酶的作用下，最終生成帶有雙標記的擴增產物。 在試紙條上，擴增產物先與帶有 FAM 抗體的膠體金 結合，再在檢測線上被生物素抗體捕捉，使檢測線 顯色，達到檢測目的。目前，英國公司 TwistDX Inc 基于以上兩種探針，已分別開發出 TwistAmp? exo 試 劑盒和 TwistAmp? nfo 試劑盒。TwistAmp? exo 試劑盒 是用于熒光檢測，不過將 Nfo 替換成了核酸外切酶 III（exo），而 TwistAmp? nfo 試劑盒是用于試紙條檢測。 目前，RPA 已經可以替代傳統 PCR 實現檢測，特別 是在病毒檢測方面頗具競爭力，如裂谷熱病毒， 檢出限達到 19 個拷貝 ；艱難梭狀芽孢桿菌，檢 出限為 1 000 個 DNA 拷貝，相當于 1fg DNA ；布魯 氏菌，檢出限可低至 3 個拷貝。

RPA 其優點在于 ：反應全程等溫進行，不需熱 變性 ；引物設計簡單 ；靈敏度高，最低能檢測出僅 含一個拷貝的樣品 ；特異性強，可進行多重 RPA。 RPA 的主要缺點：由于引物（30-35 nt）與探針（46-54 nt）較長，不適合較短靶序列的檢測；RPA 反應 條件較苛刻，不適合直接擴增粗樣品。

1.6 信號介導RNA擴增技術

Wharam 等于 2001 年創建了信號介導 RNA 擴 增 技 術（Signal-mediated amplification of RNA technology，SMART）。SMART 與 NASBA 一 樣， 是 一種依賴 RNA 轉錄的等溫擴增技術。但是，SMART 不是通過增加靶序列拷貝數實現檢測，而是通過信 號的放大來進行。

SMART 體系含有兩條探針，分別是延伸探針 和模板探針。兩條探針均有一個區域可分別與靶序 列互補結合，同時還含有另一個可相互互補結合的 區域，從而兩條探針與靶序列形成 SMART 反應中 關鍵的三通結構（Three-way junction，3WJ）。延伸 探針在 Bst DNA 聚合酶的作用下，以模板探針為模 板，形成雙鏈 T7 RNA 聚合酶啟動子和雙鏈轉錄模 54 生物技術通報 Biotechnology Bulletin 2017,Vol.33,No.7 板。雙鏈啟動子激活 T7 RNA 聚合酶不斷對轉錄模 板進行轉錄，線性合成 RNA 信號。為了獲得更佳的 檢測靈敏度，可進一步擴增 RNA 信號，將已生成 的 RNA 信號與另一條探針結合，該探針結構與模 板探針結構相似，也有 T7 RNA 聚合酶啟動子以及 轉錄模板。后續的擴增過程與先前的擴增相同，雙 鏈 T7 RNA 聚合酶啟動子和雙鏈轉錄模板生成，T7 RNA 聚合酶不斷對轉錄模板進行轉錄，線性合成 新的 RNA 信號。RNA 信號用酶聯寡核苷酸吸附實 驗（Enzyme-linked oligosorbent assay，ELOSA）進行 檢測。

SMART 是一種特殊的等溫擴增技術，通過擴增 信號來檢測靶序列。Wharam 等使用 SMART 成功檢 測大腸桿菌基因組 DNA 和總 RNA 中的特異性序列， 甚至不需要提取核酸，直接進行檢測。Hall 等 選用 g20 基因，使用 SMART 成功區分海洋噬藻體 的兩個種——S-PM2 和 S-BnM1，證明 SMART 可直 接檢測粗樣品。Murakami 等首次將 3WJ 結構與 PG-RCA 聯合使用，成功檢測人 CD4mRNA，其中 PG-RCA 起著信號放大的作用 ；周敏等使用相同 的方法也成功檢測到腸道病毒 71 型，其檢測限低至 埃摩爾級，靈敏度極強。經實驗驗證，SMART 的主 要優點為 ：檢測范圍廣，既可檢測 DNA，也可檢測 RNA ；探針設計簡單，只需設計與靶序列結合的區 域，其它的都是通用序列區域 ；特異性強，只有形 成 3WJ 結構，RNA 信號才能生成 ；可直接檢測粗提 樣品。由于 SMART 還存在較多的不足，如反應 時間長、靶序列須是單鏈核酸片段、操作繁雜、靈 敏度較低等，目前相關的應用報道還較少。SMART 在接下里的發展中，應該專注于提高檢測靈敏度， 發展比 ELOSA 更高效的檢測方法，以及將擴增與檢 測集中于一個試管中。

1.7 單引物等溫擴增

單引物等溫擴增技術（Single primer isothermal amplification，SPIA） 由 Kurn 等［56］ 于 2005 年 首 次 報道。該技術主要通過使用一條嵌合引物“5'-RNADNA-3'”、RNase H 和具有強鏈置換活性的 DNA 聚合 酶來實現核酸等溫擴增。

反應初期，嵌合引物與單鏈 DNA 模板互補結 合，在 DNA 聚合酶的聚合作用下開始延伸。同時， RNase H 降解嵌合引物與模板形成的雜合鏈 DNA ： RNA 中的 RNA 鏈，使未結合引物 RNA 部分與模 板結合，在 DNA 聚合酶的鏈置換活性下，新引物置 換舊引物的延伸產物，并開始延伸。與此同時，新 引物與模板形成的雜合鏈中的 RNA 鏈再次被 RNase H 降解，如此循環，進行線性擴增，從而產生大量 與單鏈 DNA 模板互補的單鏈 DNA 產物。若想限制 產物的長度，可使用鏈終止多聚核苷酸（Blocker）。 Blocker 能 與 單 鏈 DNA 模 板 結 合， 當 引 物 延 伸 至 blocker 時，將停止延伸，這是因為 blocker 中的部分 堿基已被修飾，其與模板的結合力大大增強，DNA 聚合酶無法置換出 blocker。為防止 blocker 發生延 伸反應，其 3' 端也需要進行修飾。在 SPIA 的 基礎上，通過添加逆轉錄酶，可實現以 RNA 為模板 擴增 DNA，該技術被稱為 Ribo-SPIA，其檢出限為 1 ng RNA，且具有很好的重復性。

SPIA 的主要優點在于 ：使用單引物，減少了 引物二聚體的形成 ；不受 RNA 干擾 ；反應機制簡 單，效率高。目前，其已被用于基于表達分析以及 病原菌檢測，同時證明該技術在檢測沙門氏菌 方面比 qPCR（quantitative PCR，qPCR）具有更好的 靈敏度和特異性。但是，SPIA 也存在其缺點 ：模板 是單鏈核酸，需對雙鏈核酸進行熱變性處理 ；需對 blocker 進行堿基修飾，提高擴增成本 ；引物是嵌合 引物，設計較復雜。

1.8 嵌合引物引發的核酸等溫擴增

嵌合引物引發的核酸等溫擴增技術（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids，ICAN）與 SPIA 相 似， 均 主 要 依 靠 嵌 合引物、RNase H 和具有強鏈置換活性的 DNA 聚 合 酶， 不 過 ICAN 需 要 一 對 引 物， 同 時 引 物 中 的 DNA 與 RNA 序列排布位置與 SPIA 的引物相反，是 “5'-DNA-RNA-3'”構型。ICAN 的擴增產量高度依賴 引物濃度，隨著濃度的增高，產量顯著提升。

重復“nick-and-run”是 Mukai 等對 ICAN 擴 增機制提出的第一個假設。一條引物與模板結合后， 在 DNA 聚合酶的作用下開始延伸。隨即，RNase H 切割引物 RNA 部分與引物延伸產物之間的結合點， 2017,33(7) 王大洲等 ：核酸等溫擴增技術在微生物快速檢測中的研究進展 55 形成缺口。DNA 聚合酶再次作用于 RNA 3' 端，在 置換出下游 DNA 的同時，引物開始重新延伸，結合 點再次形成。RNase H 再次切割結合點，在 DNA 聚 合酶的作用下，引物繼續重新延伸，進入循環擴增。 得到的單鏈 DNA 則作為另一條引物的模板進行擴 增，原理相同。依照重復“nick-and-run”擴增機制， 擴增產物中不應含有 RNA 殘基，然而經序列分析， 發現擴增產物中存在著大量帶有 RNA 殘基的產物。 因此，Uemori 等認為 ICAN 還存在著其它反應 機制，他們分別提出了“multi-priming”和“templateswitching”兩種新機制。經研究發現，RNase H 引物 存在 2 個或更多 RNA 殘基時，RNase H 會優先切割 RNA 殘基 5' 端，并且是從引物上最后一個 RNA 殘 基開始一個一個切割，即使只剩最后 1 個 RNA 殘基， RNase H 也能有效切割殘基的 5' 端。但是，“multipriming”和“template-switching”兩種新機制都是基 于只切割引物上最后一個 RNA 殘基 5' 端建立起來 的，因此，實際上，ICAN 的擴增機制可能會更加復雜。

與其它核酸擴增技術一樣，ICAN 也可用于病原 菌檢測。Isogai 等使用 ICAN 通過擴增 invA 基因 來檢測死雞、蛋黃和牛糞中的沙門氏菌，且在死雞 沖洗液的檢測中，ICAN 的檢出率高于 PCR。Horii 等結合層析技術，應用 ICAN 成功快速檢測出淋 球菌對氟喹諾酮類藥物的抗藥性。Urasaki 等在 ICAN 的基礎上，引入環狀探針，對 44 個樣品中的 柑橘黃龍病菌進行檢測，相比常規 PCR，ICAN 的檢 測時間可以至少節約 2 h，同時靈敏度更高。

綜上，ICAN 的主要優點在于擴增效率高、穩定 性好、擴增對象范圍廣，除了雙鏈 DNA，還可作用 于 cDNA ：RNA 雜合鏈。但是，由于 ICAN 使用的 引物是嵌合引物，由 RNA 和 DNA 構成，合成較復雜， 且擴增機制不明確，進而不利于該技術的發展。

2 依賴于切刻內切酶的等溫擴增技術

解決不依賴高溫使 DNA 模板變性進而引發擴 增反應，是實現真正等溫擴增反應的瓶頸。雖然， DNA 解旋酶等被用來產生 DNA 單鏈，但是效果一般， 反應機制復雜。切刻內切酶的發現，使得等溫產生 DNA 單鏈成為可能。切刻內切酶（Nicking Enzyme）， 也稱為切口酶，由美國 NEB 公司開發，其為一種限 制性內切酶，能夠識別特異性的核苷酸序列，并且 在序列內部或首尾處發生單鏈切割 ；該過程對底物 DNA 沒有要求，即不需要有任何化學修飾。因此， 依賴切刻內切酶作為反應第一步的等溫擴增技術逐 漸被發展起來。

2.1 鏈置換擴增技術（Strand displacement amplification，SDA）

置換擴增技術是一種 DNA 體外等溫擴技術，由 美國 Beetonniekinson 研究中心 Walke博士團隊 于 1992 年首次報道，此方法的建立標志著一種新型 DNA 擴增技術的誕生。

SDA 反應全過程主要依賴于限制性內切酶對半 硫代磷酸化堿基對應互補鏈的切割作用，以及聚合 酶 exo-klenow 對切口的延伸作用和對下游 DNA 片段 的置換作用。SDA 由兩條引物 P1 和 P2 進行擴增， 兩條引物的 3' 端和 5' 端分別含有特異性結合序列和 Hinc II 識別序列，其具體的擴增方式是 ：限制性內 切酶首先識別半硫代磷酸化堿基對應的互補鏈，然 后切割該位置并產生單鏈切口 ；被切割部分的 5' 上 游端能夠作為一條引物，在具有鏈置換活性的 DNA 聚合酶的作用下從 5' 端向 3' 端延伸擴增，從而剝 離原本已經形成互補的 DNA 鏈 ；被取代下的單鏈 DNA 再與另一條引物結合，相同原理下延伸形成一 條新的雙鏈 DNA。SDA 反應即是通過這種“切口 - 擴增 - 置換”循環往復的過程，達到靶序列高效擴 增的目的，其一般反應條件為 37-40℃，經過 2 h 循 環靶序列可得到 108 倍的擴增量。

 SDA 被發明后，在 20 余年的發展更新中，該 技術在細菌病毒檢測、核酸定量、重金屬檢測及芯 片雜交等多個方面有相關報道，同時也衍生出了 一些新方法。Little 等 將 SDA 與熒光共振能量 轉移技術結合，開發出新一代 DNA 探針系統—BD ProbeTecTM ET 系統，用于檢測沙眼衣原體、淋病奈 瑟菌和人乳頭狀瘤病毒 ；Nuovo 等應用 RT-SDA 檢測丙型肝炎病毒 ；Li 等研發出一種 SDA 結合 核酸酶高效檢測二價鉛離子的方法。

SDA 提供了一種可用于核酸診斷分析的擴增方 法，具有等溫核酸擴增的通用優勢 ：無須熱變性、 特異高效、操作簡便，只需一個恒溫器，大大簡化 56 生物技術通報 Biotechnology Bulletin 2017,Vol.33,No.7 了對所需儀器的要求。但是 SDA 由于反應原理和 反應體系的復雜性，不可避免的帶來了很多缺點 ： 非標準核苷酸的使用，經硫基修飾的單核苷酸在價 格上比普通的單核苷酸高出很多倍，增加了反應成 本；經硫基修飾的單核苷酸不是 DNA 聚合酶的 天然底物，修飾的核苷酸與標準核苷酸存在競爭關 系，聚合酶容易從 DNA 模板上掉落，大大降低了擴 增效率降低了擴增效率，所以，SDA 不可能合成較 長的產物，一般不超過 200 bp；SDA 產物末 端帶有限制性核酸內切酶的識別序列或其殘端，使 其不適合直接用于克隆，因此，該技術在基因工程 方面不占優勢；SDA 的等溫過程是兩步法，需要 首先有變溫過程打開雙鏈與引物退火，這就需要酶 體系在變溫環節后添加，增加了外源污染的可能性。

2.2 指數擴增反應（Exponential amplification reaction，EXPAR）

指數擴增反應由 Van Ness 等于 2003 年開 發，該技術利用擴增模板合成寡核苷酸，長度為 8-16 mer，可用于位點多態性研究。反應試劑中 的 N.BstNBI 切口酶在反應中發揮著至關重要的作用， 因此，也可以把該技術稱為切口酶擴增反應（Nicking enzyme amplification，NEAR）。

EXPAR 能否順利開展，取決于觸發反應。而觸 發反應存在著不同的機制，其中最簡單的一種機制 是依賴基因組 DNA 上存在著切口酶的識別序列。單 鏈基因組 DNA 與觸發模板退火結合，雙鏈識別序列 形成，激活切口酶切割單鏈基因組 DNA 識別序列， 缺口下游帶有 3' 懸掛的 DNA 序列，其在 60℃下自 動解離，同時上游 DNA 序列以觸發模板為模板，在 DNA 聚合酶的作用下開始延伸，合成平末端的 DNA 序列。與此同時，新形成的識別序列再次被切割， 缺口下游的 DNA 序列自動解離，成為觸發子。上游 DNA 序列繼續延伸，切口酶繼續切割，從而線性生 成觸發子，反應進入指數擴增階段。形成的觸發子 與擴增模板 3' 端序列結合，在 DNA 聚合酶的作用 下開始延伸，形成雙鏈 DNA，切口酶切割識別序列， 形成缺口，缺口下游序列自動解離，解離的單鏈片 段隨即與自由的擴增模板結合形成短暫雙鏈結構， 在 DNA 聚合酶的作用下，解離的片段一旦開始延伸， 雙鏈結構就會穩定下來，不會輕易解離，最終生成 新的雙鏈 DNA。新生成的雙鏈 DNA 重復之前的過程， 繼續合成其它新的雙鏈 DNA。在這個過程中，每個 雙鏈 DNA 也會線性生成單鏈片段，從而達到指數擴 增的目的。

EXPAR發展至今，已被廣泛應用于檢測蛋白 質 和 DNA。Nie 等基 于 EXPAR， 開 發 出 GQEXPAR，這是一種依賴 G- 四鏈體的雙重擴增技術， 可通過聯合比色法檢測 DNA。Ma 等創建了一種 用于檢測轉錄因子的技術，該技術是在 GQ-EXPAR 的基礎上，再加入 RNA 轉錄技術實現檢測的目的。 Yu 等聯合 EXPAR 和 HCR 開發出一種電化學傳 感器，可對 H7N9 病毒實現超靈敏檢測。EXPAR 的 主要優點在于：反應形式多，可滿足不同的擴增需求； 反應穩定性好，速度快，靈敏度高。但由于反應機 制復雜，產物產量易受擴增模板限制，使得后期會 從指數擴增轉變為線性擴增。

2.3 切刻內切酶介導等溫核酸擴增技術（Nicking enzyme mediated amplification，NEMA）

切刻內切酶介導等溫核酸擴增技術是 2006 年 研發的一種全新的核酸恒溫擴增技術，該技術是在 SDA 的基礎上發展而來的不依賴于特殊化學修飾的 等溫方法。NEMA 反應體系中使用的切刻內切酶， 是一種能夠識別特異性的位點并發生自然單鏈切割 產生缺口的酶，切刻內切酶的使用克服了傳統 SDA 反應中需要添加化學修飾的非標準核苷酸的缺陷， 簡化了反應體系，提高了反應效率，成本更低，并 且可合成長鏈 DNA。

NEMA 反 應 體 系 包 括 兩 對 引 物（ 剝 離 引 物 B1/B2，切割引物 S1/S2）、一種具有鏈置換活性的 DNA 聚合酶、一種能夠識別特異性切割位點的切刻 內切酶、額外添加的鎂離子以及適宜的緩沖溶液。 NEMA 技術是建立在 SDA 的原理技術上改進發明的， 因此二者基本擴增原理相似。NEMA 擴增分為“切 割單鏈形成切口”和“鏈置換剝離舊鏈”兩個過程， 在待擴增的 DNA 雙鏈模板上有一段切口酶特異識別 的序列，在切口酶的作用下只切割其中一條鏈，然 后 DNA 聚合酶以形成的切口為起點，以未被切斷的 單鏈為引物延伸形成新鏈，置換舊鏈，產物作為新循環的模板不斷參與新一輪的指數擴增。體系中還 存在另外一種模板，就是只上游或者下游一端引入 了切刻內切酶識別位點的序列，這種狀態的靶序列 同樣是以不斷結合雜交互補的切割引物參與擴增， 然后發生單鏈切口切割，在 DNA 聚合酶作用下鏈置 換，如此的往復循環過程。

相較于 SDA 和其他目前開發的等溫核酸技術， NEMA 具有一些潛在的優勢 ：酶體系和原材料體系 的簡單減少了抑制因子的干擾 ；擴增迅速，反應時 間短，在 1 h 之內就能達到電泳凝膠的觀察要求 ； 低成本，操作簡單，對操作儀器的要求不高，為核 酸擴增技術的推廣創造了條件。但是 NEMA 目前還 處于探索階段，多數應用在微生物質粒 DNA 的檢測 方面。

3 結語

本文介紹了 10 余種等溫擴增技術，其中每種技 術均有各自的優勢，表 1 比較了上文提到的幾種等 溫核酸擴增方法的技術特點。盡管等溫擴增技術有 著普通 PCR 擴增不可超越的優勢，但是有些缺點也 是不容忽視的。不過，隨著進一步研究，對生物過 程的了解越來越深入，相信未來將會有更多更完善 的新型等溫擴增技術不斷涌現。

等溫擴增技術是在單一溫度下對靶序列進行擴 增或信號放大，不依賴便攜性差、價格昂貴的熱循 環儀，進而在近 20 多年得到快速發展，尤其是在微 生物檢測領域中。我國現行標準（GB/T，SN/T 等） 中有多項采用了等溫檢測的方法，包括金黃色葡萄 球菌、產氣莢膜梭菌、創傷弧菌、阪崎腸桿菌、沙 門氏菌等致病菌 ；豬圓環病毒 2 型、家畜布魯氏菌、 焦枯病菌、甘蔗病原菌和豬瘟病毒等。等溫擴增技 術對儀器要求簡單，僅以電池為電源的加熱器即可， 未來可在邊遠地區和基層醫療單位等缺乏資金和先 進檢測設備的地區大力推廣，使其具備快速診斷病 原體的能力。檢測時間短也是等溫擴增技術的優勢， 可在實時現場檢測與監測領域推廣，如在突發公共 衛生事件的現場診斷中，等溫技術對傳染性疾病的 早期發現和控制具有重要的意義。

歷經了 20 余年的發展，在市場上仍然看不到任何已 經被廣泛使用的相關設備。但是，導致這種現象的原因并非等溫擴增技術不適用，而是因為這是一個 復雜的工程問題，是一個涉及多領域的難題。想 研發出以核酸為靶物質的便攜快速即時檢測設備， 我們需要對等溫擴增技術進行更多的優化，比如擴 增速率，電力需求等等，同時需要解決將等溫擴增 與上下游操作結合在一起的技術難關，如結合樣品 核酸的提取純化以及后期的擴增產物檢測。隨著 微型品制造技術與等溫擴增技術的不斷提升，相 信在不久的將來將會出現突破性的進展。

文獻來源：DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0106

作者：王大洲， 郭天笑，鄭實，商穎，許文濤

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