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固定化酶微反應器的應用

上個世紀90年代,庫爾團隊開始利用酶微反應器結合毛細管電泳(CE)技術對蛋白質進行線酶解和谷氨酸鹽分析。Fréchet和Svec研究組利用整體柱酶微反應器進行肽譜分析和抗體的研究。目前,固定化酶微反應器的穩定性和催化效率均有了顯著的提高,已成為生命科學、化學、藥學等領域的研究熱點。

作為繼人類基因組計劃后的又一重大生命科學課題,蛋白質組學是一個非常復雜的生物系統工程。作為shotgun技術的補充,固定化酶微反應器為蛋白質組學的順利實施提供了有力的支撐。利用所制得的全柱酶微反應器和納米反相液相色譜-串聯質譜聯用技術,首次實現了復合蛋白混合物的酶解分析。

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結果表明,在590ng酵母蛋白酶解產物中,共鑒定出1578個獨立肽段,541個不同蛋白,酶解時間從16小時縮短到1分鐘。Liu團隊將制備的納米金膠芯片酶反應器與強陽離子交換-反相層析-電噴霧離子化串聯質譜聯用,對小鼠巨噬細胞系AMJ2-C8蛋白樣品進行酶解和快速分離測定,共497個蛋白質實現了準確的鑒定。在此基礎上,Zhang團隊利用微反應器構建了多維蛋白質分析平臺,為蛋白質組學的高通微量化分析研究奠定了基礎。

研究人員使用具有氨基功能的全復合柱胰蛋白酶微反應器與μPRLC-ESI-/MS/MS/MS/MS聯用,構建了一種在線蛋白變性、還原、酶解、分離、檢測等蛋白質分析平臺,使蛋白質樣品預處理時間縮短到3.5min。再將點擊麥芽糖親水作用色譜柱、強離子交換預柱、肽-N-糖苷酶F微反應器組成的多級處理系統,實現了多級蛋白樣品處理系統的同步實現,能同時進行多肽富集、樣品緩沖液的更換以及脫糖基化。

首次用于蛋白質N-連接糖基化位點的研究,可選擇性地檢測酶解產物糖基糖肽,來自抗生素共存干擾物50倍以上。同時,樣品的預處理時間也只需1h左右,而樣品的檢測限值僅為5fmol。與nanoRPLC-ESI-MS/MS相結合,對6μg大鼠腦液酶解樣品進行了分析檢測,共檢測到120個糖蛋白和196個N-糖基化位點肽,其中有61個是首次發現的。本系統對高通量、高效、高靈敏度的糖蛋白組學檢測具有重要意義。酶微反應器還可以用于藥物的高通量篩選。

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酶靶向抑制劑藥物的篩選是目前分子靶向藥物研究的一個重要方向。酶微反應器是一種高效、自動化的藥物篩選方法,但傳統的藥物篩選方法效率低、能耗高。阿茲海默病(AD)被稱為老年癡呆癥,是一種廣泛關注的老年疾病。AD的發生與乙酰膽堿酯酶(AChE)密切相關,在臨床上應用較多的是AchE抑制劑。

通過CE和AchE的聯合應用,對AChE抑制劑進行了篩選,從40多個天然藥物庫中快速篩選到4個AchE抑制劑。由于CE篩選出的藥物峰容量不足,用磁性聚苯乙烯微球作為載體,結合CE進行堿性磷酸酶毛細管微反應器的篩選,峰容量提高了20倍。抗癌藥物前藥活性是藥物開發的重要組成部分。通過與HPLC相結合,對硝基苯硝基還原酶進行抗腫瘤藥物的篩選。在線酶抑制劑的篩選中,毛細管整體柱腺苷脫氨酶酶反應器與nanoLC相結合。酶微反應器作為一種綠色環保、高效易控的催化合成技術,近年來在生物轉化方面也日益受到關注。

采用白念珠菌酯酶B反應器進行內酯聚合,可以得到比傳統聚合反應大得多的產物。采用脂肪酶PS微膜反應器進行了苯醇和醋酸乙烯酯的手性催化酯交換反應,3維立方結構MPS膜載體制備的微反應器,轉化率高達64%,手性選擇性大于99%。

采用酯酶微反應器對乙酸異戊酯進行生物合成,比傳統方法提高3倍。在此基礎上,采用脂肪酶反應器選擇性合成C-6位羥基乙酰化。本發明的反應時間縮短到30分鐘,并具有較高的收率和選擇性。同時,利用酶微反應器對酶性能進行評價。以葡萄糖氧化酶為模型,用固定化酶微反應器研究酶動力學。實驗結果表明,微反應器富集酶活性較好,酶學參數與濃度有較好的線性關系。酶的活性是微反應器的一個重要性能指標。對酶活性評價方法進行了相關研究,為活性表征提供了簡便而有效的方法。

用胰蛋白酶結合纖維素膜形成一種填充層析。采用HPLC前沿分析方法,在線監測胰蛋白酶底物N-苯甲酰-DL-精氨酸對硝基苯酰胺的水解產物中硝基苯胺的含量,并計算胰蛋白酶底物中硝基苯胺的含量,從而評價固定酶活性。用胰蛋白酶在多孔硅載體上進行共價鍵合,與離子化質譜相結合,檢測酶催化底物產生的產物的量,從而測定酶活性。

另外,多種酶結構的微反應器也被廣泛應用于生化級聯反應。以蔗糖酶、葡萄糖氧化酶和辣根過氧化酶在微通道中分段固定,通過反應物進入通道,通過調節三種酶的固定順序,觀察酶的生成順序對產生產量的影響。用谷氨酸脫氫酶與谷丙轉氨酶同時固定于毛細管內壁,通過循環反應產生信號放大效應,用于谷氨酸含量的高靈敏度檢測。



標簽:   微反應器
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