數(shù)字核酸定量技術(shù)的迅速發(fā)展在精準(zhǔn)定量方面已經(jīng)展現(xiàn)出絕對(duì)的優(yōu)勢(shì), 將被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域和基礎(chǔ)研究中, 例如癌癥早期診斷^[1-4]、產(chǎn)前診斷^[5]、單細(xì)胞分析^[6]、病原菌檢測(cè)^[7]、食品安全^[8]、高通量測(cè)序^[9]、單核苷酸多態(tài)性^[10]等領(lǐng)域。目前, 已經(jīng)商品化的數(shù)字核酸定量技術(shù)為數(shù)字PCR芯片系統(tǒng), 主要是液滴型和孔板型兩種。

孔板型以Life-Tech QuantStudio^TM 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)為代表, 液滴型以Bio-Red QX200微液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)為代表。這些商業(yè)化的數(shù)字PCR反應(yīng)系統(tǒng)均需特定儀器輔助進(jìn)樣或產(chǎn)生液滴，以及進(jìn)行結(jié)果判讀。儀器成本高, 且操作復(fù)雜, 不適用于普通實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用, 更難用于災(zāi)害現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)診斷和條件落后的偏遠(yuǎn)地區(qū)。這兩種商業(yè)化芯片的微反應(yīng)個(gè)數(shù)都在20 000左右, 微反應(yīng)的體積為納升級(jí)。對(duì)于數(shù)字PCR來(lái)說(shuō), 隨著微反應(yīng)數(shù)量的增加, 其靈敏度、精確度和動(dòng)態(tài)范圍都會(huì)得到提高^[11]。降低微反應(yīng)的體積可以提高單拷貝檢測(cè)效率, 降低污染, 增加通量, 降低試劑消耗^[12]。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為另外一種核酸檢測(cè)技術(shù), 與PCR相比有簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、無(wú)需溫度循環(huán)的優(yōu)點(diǎn)^[13], 終點(diǎn)檢測(cè)可以利用濁度^[14]和離子指示劑^[15]顏色變化進(jìn)行可視化檢測(cè), 也可通過(guò)核酸嵌入染料SG (SYBR GreenⅠ) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。本研究組開(kāi)發(fā)了一種等溫多底物自配引發(fā)擴(kuò)增技術(shù)(isothermal multiple self-matching-initiated amplification, IMSA)^[16]。IMSA共有3對(duì)引物, 分別是一對(duì)外引物DsF/DsR, 一對(duì)內(nèi)引物FIT/RIT和一對(duì)莖引物SteF/SteR, 其中外引物和內(nèi)引物均是混合式引物。IMSA擴(kuò)增可分為兩個(gè)階段:一是原始自我配對(duì)結(jié)構(gòu)(self-matching structure, SMS) 的生成; 二是基于SMS的自我循環(huán)擴(kuò)增(cycling amplification)。IMSA和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 均具有同樣的優(yōu)點(diǎn):(1) 特異性強(qiáng); (2) 靈敏度高; (3) 擴(kuò)增效率高; (4) 結(jié)果易判讀; (5) 可擺脫儀器, 適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè); (6) 檢測(cè)時(shí)間短。由于IMSA和LAMP的引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增原理不同, IMSA的靈敏度比LAMP更高^[16]。同時(shí), IMSA體系中羥基萘酚藍(lán)(hydroxynaphtholblue, HNB) 和SG的雙熒光指示系統(tǒng)已被證明可用于微流控芯片, 且有比SG的單色熒光更好的指示性能^[17]。

本文在本研究組前期研發(fā)的自吸式微流控芯片^[18, 19]基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了新的結(jié)構(gòu), 增加了反應(yīng)小室的密度, 縮小了其體積, 大大增加了芯片單位面積的反應(yīng)小室數(shù)量, 提高了芯片核酸定量的性能。并結(jié)合雙熒光顯色的IMSA反應(yīng)系統(tǒng)^[17], 開(kāi)發(fā)了結(jié)合雙熒光IMSA擴(kuò)增的高密度皮升級(jí)微流控核酸定量芯片。芯片用多層軟光刻技術(shù)制成, 以聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS) 和玻璃為材料。以HBV質(zhì)粒為模板進(jìn)行芯片上的定量測(cè)試, 實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的精確定量。本裝置具有定量精確、靈敏、快捷、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì), 可用于核酸精準(zhǔn)定量檢測(cè)。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

MGL96G型PCR儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司); Maestro Ex IN-VIVO IMAGING SYSTEM熒光成像儀(美國(guó)CRI Maestro公司); IX71型熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司); H94-25C型單面光刻機(jī)(中國(guó)四川南光公司); SU-8 2025及SU-8 3025負(fù)性光膠(美國(guó)MicroChem公司); PDMS (美國(guó)Dow Corning公司); 三甲基氯硅烷(中國(guó)阿拉丁公司); SYBR Green I及無(wú)核酸酶水(美國(guó)Life Technologies公司); 羥基萘酚藍(lán)(HNB，商品目錄號(hào)63451-35-4，中國(guó)Lemongreen公司); Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(8 U/ μL), dNTPs (10 mmol/L), MgSO₄(100 mmol/L), 和10×等溫?cái)U(kuò)增緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L KCl, 10 mmol/L (NH₄)₂SO₄, 2 mmol/L MgSO₄, 0.1%(v/v) Tween-20)(美國(guó)New England BioLabs公司); 甜菜堿(商品目錄號(hào)107-43-7，英國(guó)Sigma-Aldrich公司); HBV質(zhì)粒(中國(guó)生工公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 等溫核酸定量微流控芯片的制作

首先制作芯片模具。用Corel DRAWX4繪制芯片圖形, 如圖 1a所示。芯片模具采用多層軟光刻技術(shù)制成。在干凈的硅片上旋涂SU-8 3025, 厚度30 μm, 于95 ℃烘烤15 min。然后將有微通道圖樣的掩膜緊貼在光膠上, 紫外曝光20 s。再次升溫至95 ℃, 保持5 min。旋涂SU-8 2025, 厚度90 μm, 于95 ℃烘烤25 min。將小室圖樣掩膜貼在光膠上, 利用對(duì)準(zhǔn)設(shè)備將掩膜與已曝光的通道層圖案對(duì)準(zhǔn)。紫外照射34 s。于65 ℃和95 ℃分別烘烤3 min和12 min。最后, 將硅片浸泡在顯影液中, 洗去未曝光的光膠。最后升溫至250 ℃, 烘烤30 min, 將兩次曝光圖形融合。

芯片構(gòu)成如圖 1b所示。制作芯片前將模具在三甲基氯硅烷中浸泡5 min, 使模具表面硅烷化。首先制作空白層, 作為芯片的封底, 防止核酸吸附到蓋玻片上。將PDMS單體(A) 和固化劑(B) 按照30 : 1(質(zhì)量比, 下同) 混合均勻, 并真空脫氣, 然后旋涂在干凈的硅片上, 厚約50 μm, 于90 ℃固化20 min。配制質(zhì)量比為5A : 1B的PDMS預(yù)聚物, 傾倒在模具上, 旋涂200 μm, 于90 ℃烘烤1 min固化, 為反應(yīng)小室層。在反應(yīng)小室層上旋涂一層納米防蒸發(fā)層。將剩余的PDMS預(yù)聚物倒在納米防蒸發(fā)層上, 于90 ℃固化1 h, 制作支撐層, 為反應(yīng)小室提供負(fù)壓, 并且有利于脫模。固化后, 納米防蒸發(fā)層被嵌入支撐層和反應(yīng)小室層中間, 3層融合成芯片主體。脫模, 打孔, 將芯片主體圖案一面貼在空白層上, 于100 ℃烘烤40 min使兩層PDMS融合。用等離子體處理空白層和干凈的蓋玻片, 進(jìn)行貼合, 芯片組裝完成。蓋玻片用來(lái)維持負(fù)壓狀態(tài)下芯片的形狀。最后配制10A : 1B的PDMS預(yù)聚物, 于90 ℃固化1 h, 制作真空儲(chǔ)氣層。將其貼在出樣口處, 提供持續(xù)的負(fù)壓將熱凝固油相吸入通道, 封閉反應(yīng)小室。

1.2.2 擴(kuò)增體系配置和進(jìn)樣

20 μL反應(yīng)體系中含有2 μL 10×等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、0.2 μmol/L外引物DsF和DsR、0.8 μmol/L內(nèi)引物FIT和RIT、1.6 μmol/L莖引物SteF和SteR、1.4 mmol/L dNTPs、8 U Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶、0.8 mol/L甜菜堿、6 mmol/L MgSO₄、0.4 μL 50× SYBR Green I和240 μmol/L HNB、2.0 μL稀釋至1 000拷貝/ μL的HBV質(zhì)粒, 剩余體積用無(wú)核酸酶水補(bǔ)齊。陰性對(duì)照用無(wú)核酸酶水代替模板。引物和模板序列參照文獻(xiàn)^[17]。

配制10 A : 1B的PDMS 1.1 g, 加入4 g硅油(50 cSt), 混勻真空脫氣, 作為封閉小室的油相。將芯片表面用膠帶貼合, 以延長(zhǎng)負(fù)壓保持時(shí)間。芯片真空脫氣30 min后刺破進(jìn)樣口的膠帶, 用移液器吸頭將20 μL配制好的IMSA反應(yīng)混合液加入進(jìn)樣孔。并將配制好的硅油加到反應(yīng)液的上層。在負(fù)壓的作用下, 反應(yīng)液進(jìn)入芯片, 精確分配到各個(gè)反應(yīng)小室, 見(jiàn)圖 2a。隨后油相進(jìn)入通道, 將通道中的反應(yīng)液排出, 封閉小室, 見(jiàn)圖 2b。最后將芯片的進(jìn)口和出口封閉。

1.2.3 反應(yīng)條件和數(shù)據(jù)采集

芯片在平板PCR儀上于62 ℃進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng), 反應(yīng)時(shí)間60 min。擴(kuò)增完成后分別在熒光成像儀和熒光倒置顯微鏡下檢測(cè)芯片的反應(yīng)結(jié)果。455 nm藍(lán)光激發(fā)熒光, 發(fā)射光透過(guò)495 nm長(zhǎng)波透鏡, 通過(guò)電荷耦合元件(CCD, charge-coupled device) 圖像傳感器進(jìn)行熒光圖像和數(shù)據(jù)采集。用Image J軟件分析熒光圖像, 統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性擴(kuò)增個(gè)數(shù)。利用泊松分布原理計(jì)算待檢測(cè)目標(biāo)的分子數(shù)目。

二、結(jié)果與討論

2.1 等溫?cái)U(kuò)增微流控芯片

本文中的等溫?cái)U(kuò)增芯片實(shí)際尺寸40 mm×55 mm, 厚度約3 mm。共有3個(gè)樣品通道, 每個(gè)樣品進(jìn)入4個(gè)樣品反應(yīng)區(qū), 共計(jì)12個(gè)反應(yīng)區(qū), 每個(gè)反應(yīng)區(qū)有10 048個(gè)反應(yīng)小室, 共有120 576個(gè)反應(yīng)小室, 芯片反應(yīng)室的密度達(dá)7 000個(gè)/cm²。每個(gè)小室的尺寸為50 μm×50 μm×120 μm, 反應(yīng)體積為300 pL, 整張芯片的載樣量為36 μL。根據(jù)Heyries等^[12]在文獻(xiàn)中給出的動(dòng)態(tài)范圍計(jì)算公式, 該芯片理論上可檢測(cè)模板的動(dòng)態(tài)范圍為6個(gè)數(shù)量級(jí), 可檢測(cè)的最大模板量為1.13×10⁶拷貝。芯片材料為PDMS和玻璃, 具有較好的透光性。芯片實(shí)物見(jiàn)圖 3。

2.2 納米防蒸發(fā)層性能研究

由于PDMS的氣透性及長(zhǎng)時(shí)間在62 ℃保溫會(huì)引起反應(yīng)液水分的蒸發(fā), 少量的蒸發(fā)對(duì)于微量反應(yīng)體系就可能造成嚴(yán)重結(jié)果。特別是反應(yīng)區(qū)域邊緣的小室, 蒸發(fā)尤為嚴(yán)重(見(jiàn)圖 4a)。本文采用一種納米防蒸發(fā)涂層嵌入到反應(yīng)小室的上方, 防止蒸發(fā)。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中, 芯片內(nèi)處于蒸發(fā)平衡。該納米涂層可以在小室上方形成一層透過(guò)屏障, 從而有效阻斷水蒸氣的散失, 維持蒸發(fā)平衡, 達(dá)到抑制蒸發(fā)的目的(見(jiàn)圖 4b)。

2.3 等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)結(jié)果

IMSA反應(yīng)結(jié)束后, 分別使用IX71型熒光倒置顯微鏡和Maestro Ex IN-VIVO熒光成像儀進(jìn)行熒光檢測(cè)。SG在455 nm藍(lán)色激發(fā)光下會(huì)發(fā)出綠色熒光, 最大發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm。經(jīng)過(guò)等溫IMSA反應(yīng)后, 陽(yáng)性小室的綠色熒光大幅增強(qiáng)。熒光顯微鏡下的結(jié)果如圖 5a所示。亮綠色為含有模板的陽(yáng)性擴(kuò)增小室, 暗綠色為無(wú)模板的陰性小室。同時(shí), 陽(yáng)性反應(yīng)小室與相鄰陰性小室間熒光的差異明顯, 說(shuō)明熱凝固油相有很好的封閉小室的作用, 并無(wú)交叉污染現(xiàn)象。

本實(shí)驗(yàn)中加入的HNB可實(shí)現(xiàn)熒光可視化檢測(cè)。由于顯微鏡為窄帶濾光片, HNB的紅色熒光(最大發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm) 被過(guò)濾, 但是在熒光成像系統(tǒng)中呈現(xiàn)明顯的雙色熒光, 如圖 5b所示。綠色小室為含目標(biāo)片段的陽(yáng)性擴(kuò)增小室, 紅色小室為不含目標(biāo)片段的陰性小室, 因此可以通過(guò)顏色區(qū)分小室中是否含有模板, 實(shí)現(xiàn)可視化分辨。且熒光強(qiáng)度有明顯的差異(見(jiàn)圖 5c)。雙熒光系統(tǒng)中, 陽(yáng)性熒光的指示染料SG是一種核酸嵌入型熒光染料, 雖有雙鏈選擇性, 但由于等溫?cái)U(kuò)增中的引物較多, 所以有明顯的背景熒光, 需要加入較多的HNB以掩蓋綠色熒光^[17]。本研究組已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種雙向置換熒光探針用以解決該問(wèn)題^[20], 已在96孔板上使用, 降低了背景熒光的強(qiáng)度, 有很好的反應(yīng)效果。在微流控芯片上的效果尚待驗(yàn)證。

本文采用雙熒光指示法, 由于HNB的存在, 含有模板的陽(yáng)性小室擴(kuò)增前為紅色, 擴(kuò)增后顯示綠色, 而無(wú)模板的陰性小室一直為紅色。因此在進(jìn)行陽(yáng)性小室計(jì)數(shù)時(shí), 可以很容易根據(jù)顏色區(qū)分小室中是否含有待測(cè)模板, 與只有SG的單色熒光相比, 不需劃定閾值。本文用稀釋至1 000拷貝/ μL的HBV質(zhì)粒作為模板, 檢驗(yàn)芯片定量的準(zhǔn)確性。圖 6a是熒光成像系統(tǒng)采集的反應(yīng)結(jié)果圖像；圖 6b為陰性對(duì)照, 反應(yīng)區(qū)域中無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增, 全部呈現(xiàn)陰性。圖 6中為一個(gè)反應(yīng)區(qū)的圖像, 有小室10 048個(gè), 每個(gè)小室的反應(yīng)體積為300 pL。該區(qū)域共有陽(yáng)性亮點(diǎn)287個(gè)。另外3個(gè)區(qū)域的陽(yáng)性亮點(diǎn)為858個(gè)。

2.4 核酸精確定量

核酸定量結(jié)果用泊松分布原理進(jìn)行計(jì)算。泊松分布公式為P(n, λ)=λⁿ/(e^λ×n!), n為每個(gè)反應(yīng)通道中的核酸分子數(shù), λ為核酸分子數(shù)與反應(yīng)小室數(shù)的比值, P為實(shí)際的陽(yáng)性小室的比例, 即陽(yáng)性小室與總反應(yīng)小室的比值。在沒(méi)有模板存在時(shí), 泊松分布公式為P(n=0, λ)=1/e^λ; 有模板存在時(shí)為P(n＞0, λ)=1-P(n=0, λ)=1-1/e^λ。令陽(yáng)性反應(yīng)的小室個(gè)數(shù)為W, 本次反應(yīng)中的核酸模板數(shù)為X。因此在本芯片上每個(gè)反應(yīng)通道的P=W/40 192, λ=X/40 192。泊松分布公式變?yōu)?/span>W/40 192=1-1/e^{X/40 192}, 所以每個(gè)反應(yīng)通道中的核算模板的拷貝數(shù)X=-ln [(40 192-W)/40 192]×40 192。由于核酸分子隨機(jī)性的分配, 一個(gè)陽(yáng)性反應(yīng)小室中可能含有不止一個(gè)拷貝的模板。因此該公式的意義在于將該反應(yīng)通道中的模板分子數(shù)進(jìn)行校正, 以得出準(zhǔn)確數(shù)值。再根據(jù)小室個(gè)數(shù)、每個(gè)小室的體積以及稀釋倍數(shù)計(jì)算出原始模板的濃度。本次反應(yīng)計(jì)算出加入的模板濃度為946拷貝/ μL。在本文中用到的模板濃度用紫外分光光度法測(cè)定, 稀釋至1 000拷貝/ μL。兩者有差異的原因有可能是模板斷裂、有雜質(zhì)或稀釋。針對(duì)該問(wèn)題可利用其他核酸定量系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

三、結(jié)論

本文采用新的芯片結(jié)構(gòu), 設(shè)計(jì)制作的利用PDMS儲(chǔ)存負(fù)壓為動(dòng)力的皮升級(jí)核酸精確定量微流控芯片實(shí)現(xiàn)了樣品精確分配。隨后熱凝固油相將小室封閉, 進(jìn)樣過(guò)程無(wú)需泵和閥及其他儀器輔助, 擴(kuò)增反應(yīng)快速, 無(wú)需熱循環(huán), 并且具有可精確定量、便攜、快捷、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。芯片采用的氟硅烷納米涂層可以有效地阻止反應(yīng)過(guò)程中水蒸氣的散失, 保證了數(shù)字HBV-IMSA的正常進(jìn)行, 實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)分子的精確定量。應(yīng)用雙熒光顯色系統(tǒng), 無(wú)需劃定閾值, 可以通過(guò)顏色變化區(qū)分陰性和陽(yáng)性小室, 降低了數(shù)據(jù)處理的難度。芯片上含有120 576個(gè)反應(yīng)小室, 可以分成12個(gè)含有約10 000小室的區(qū)域, 一個(gè)普通PCR熱板可同時(shí)滿足兩個(gè)芯片反應(yīng), 因此可以同時(shí)檢測(cè)24個(gè)樣本。本芯片不但可以實(shí)現(xiàn)精確定量和分子診斷, 而且增加了實(shí)驗(yàn)密度, 提高了通量, 促進(jìn)了數(shù)字核酸定量芯片的應(yīng)用。另外, 本研究組^[21]已經(jīng)研制出基于智能手機(jī)的便攜式溫控和圖像采集平臺(tái), 如配合高分辨率CCD進(jìn)行數(shù)據(jù)采集, 將極大地提高芯片在災(zāi)害現(xiàn)場(chǎng)和不發(fā)達(dá)地區(qū)的利用程度。

文獻(xiàn)來(lái)源： ＤＯＩ： １０．３７２４ ／ ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１６．１０００５

作者：吳文帥、丁雄、牟穎（科學(xué)網(wǎng)科學(xué)網(wǎng)轉(zhuǎn)載僅供參考學(xué)習(xí)及傳遞有用信息，版權(quán)歸原作者所有，如侵犯權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系刪除）