生物被膜是細(xì)菌及其自身分泌的胞外聚合物組成的微生物群落，其形成是受多種機(jī)制共同調(diào)控的多階段動(dòng)態(tài)過(guò)程，具有較強(qiáng)的耐藥性且難以清除，給醫(yī)療、食品等行業(yè)帶來(lái)了巨大的威脅。

生物被膜是為適應(yīng)環(huán)境而在有生命或無(wú)生命的物體表面形成的有組織的微生物群落。生物被膜可謂是細(xì)菌的天然保護(hù)屏障，為細(xì)菌提供了相對(duì)穩(wěn)定的生存環(huán)境。生物被膜在自然界中廣泛存在，對(duì)人類生產(chǎn)生活的各個(gè)方面都有重要影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，65%的醫(yī)源性感染與生物被膜相關(guān)，生物被膜內(nèi)細(xì)菌的耐藥性是醫(yī)療行業(yè)所面臨的重大難題之一。此外，生物被膜會(huì)引發(fā)水污染影響飲用水質(zhì)，導(dǎo)致食品污染。

生物被膜的形成不是一蹴而就的，是一個(gè)細(xì)菌粘附到基質(zhì)表面，并不斷增殖分裂形成微菌落直至生物被膜發(fā)展成熟，最后生物被膜破裂細(xì)菌重新定植的多階段動(dòng)態(tài)過(guò)程。生物被膜的形成既受外界環(huán)境的影響，又受細(xì)菌內(nèi)部基因的調(diào)控，群感效應(yīng)作為細(xì)菌進(jìn)行信息傳遞的重要機(jī)制，它在生物被膜的形成中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。

1生物被膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及形成過(guò)程

過(guò)去人們常認(rèn)為細(xì)菌傾向以游離的狀態(tài)存在，是以單細(xì)胞的方式生存，直到17世紀(jì)，VanLeeuwenhoek發(fā)現(xiàn)固著在牙齒上的細(xì)菌是以細(xì)菌群落的形式存在的，生物被膜的理論才逐漸被人們所認(rèn)可[9]。生物被膜研究之父Costerton將生物被膜定義為由粘附在有生命或無(wú)生命表面上并包裹在自分泌的胞外聚合物的細(xì)菌組成的微生物群落[4]。生物被膜廣泛存在于自然界中，其更傾向于形成在潮濕的物體表面，如食品加工設(shè)備、醫(yī)療器械等[10]。生物被膜可有效地保護(hù)其中的細(xì)菌，使得膜內(nèi)細(xì)菌具有更強(qiáng)地抵御過(guò)酸過(guò)堿、高溫、高滲透壓等不利生存環(huán)境的能力和更強(qiáng)的耐藥性，有利于細(xì)菌更好地適應(yīng)周圍環(huán)境。

生物被膜由粘附在物體表面的細(xì)菌及胞外基質(zhì)組成。胞外基質(zhì)主要指的是胞外聚合物(EPS)，它是生物被膜的主要化學(xué)成分，胞外基質(zhì)也包含蛋白質(zhì)、DNA等物質(zhì)[13]。例如，銅綠假單胞菌生物被膜胞外多糖主要是Pel、Psl和海藻酸鹽，eDNA也是銅綠假單胞菌生物被膜的重要組成成分，其作用是維持生物被膜的穩(wěn)定性[14]。生物被膜不是細(xì)菌及胞外聚合物(EPS)的簡(jiǎn)單聚合，而具有復(fù)雜的架構(gòu)。例如，銅綠假單胞菌及枯草芽孢桿菌生物被膜中點(diǎn)綴有開(kāi)放的水通道，這些水通道有利于生物被膜中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝廢物的交換[15]。

生物被膜的形成是個(gè)動(dòng)態(tài)而復(fù)雜的過(guò)程。這一過(guò)程可劃分為幾個(gè)主要的階段：可逆粘附期、不可逆粘附期、微菌落的形成、生物被膜成熟期以及散播期[16-17](圖1)。在可逆粘附期，細(xì)菌通過(guò)鞭毛或菌毛可逆地粘附到物體表面，在這一時(shí)期細(xì)菌可以脫離表面重新回到浮游狀態(tài)；之后細(xì)菌表面蛋白和胞外聚合物(EPS)協(xié)助細(xì)菌粘附到固體表面，可逆粘附轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡嬲掣絒18]，粘附期是生物被膜形成的關(guān)鍵時(shí)期，它是細(xì)菌由浮游狀態(tài)到生物被膜形成的轉(zhuǎn)折點(diǎn)；隨后粘附的細(xì)菌不斷增殖分裂，胞外聚合物(EPS)逐漸增多，形成微菌落直到形成成熟的生物被膜，在成熟的生物被膜中胞外聚合物(EPS)占生物被膜干重的90%，胞外聚合物(EPS)把生物被膜中的細(xì)菌粘附在一起，維持著生物被膜的三維結(jié)構(gòu)，使得膜內(nèi)細(xì)菌具有更強(qiáng)的耐藥性，以及抵御不良環(huán)境的能力，如增強(qiáng)生物被膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)環(huán)境中有害金屬離子的抗干擾能力[19-20]，同時(shí)胞外聚合物(EPS)可積累群感效應(yīng)信號(hào)分子、胞外酶、細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，為細(xì)菌提供了信息交流的場(chǎng)所[21]；最后，生物被膜內(nèi)細(xì)菌從成熟的膜中逃離，成為浮游菌，重新定植到新的表面，到達(dá)散播期，散播期不僅是上一個(gè)生物被膜形成周期的結(jié)束，而且是下一個(gè)生物被膜周期的開(kāi)始[22]。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)生物被膜的結(jié)構(gòu)隨外界環(huán)境的改變而改變，如銅綠假單胞菌在氧氣充足的條件下形成的生物被膜呈“蘑菇狀”，而在無(wú)氧條件下可形成三維“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)的生物被膜[23]。

圖1生物被膜形成過(guò)程示意圖

2.微流控芯片應(yīng)用于電化學(xué)阻抗生物被膜檢測(cè)

微流控芯片可集成不同的生化功能單元及實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高通量檢測(cè)，具有樣品需求量小、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，提供比常規(guī)體系更加穩(wěn)定的微環(huán)境，其用于生物被膜的檢測(cè)具有很大優(yōu)勢(shì)。將細(xì)菌引入到微流控芯片的微通道中，在微流控芯片電極檢測(cè)區(qū)形成生物被膜，可對(duì)其進(jìn)行原位阻抗檢測(cè)。此外，微流控芯片允許在人為可控的條件下研究生物被膜的生長(zhǎng)情況，為生物被膜研究及在線監(jiān)測(cè)提供了良好的平臺(tái)。在此，我們?cè)敿?xì)介紹了近幾年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道的利用電化學(xué)阻抗檢測(cè)生物被膜的微流控芯片。

Ben-Yoav等[77]設(shè)計(jì)了由2個(gè)上下平行放置的氧化銦錫涂層電極(ITO)組裝而成的微流控芯片裝置，利用多聚物加工出橢圓形電解槽，在電解槽的底部和頂部分別留有矩形凹槽便于放置氧化銦錫涂層電極，分別在電解槽兩側(cè)打孔，便于向電解槽注入細(xì)菌培養(yǎng)液以及排除廢液。將大腸桿菌菌液通入到該芯片中，完成細(xì)菌在氧化銦錫涂層電極上的粘附和形成生物被膜，再插入Ag/AgCl電極作為參比電極，與上下2個(gè)平行放置的氧化銦錫涂層電極構(gòu)成三電極體系進(jìn)行阻抗測(cè)試，利用等效電路模型分析了由大腸桿菌粘附及其生物被膜生長(zhǎng)引起的電容和電阻的變化情況，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)0–23h電容值升高而電阻值下降，之后電容值下降而電阻值升高，電容及電阻值的變化情況與大腸桿菌生物被膜的生長(zhǎng)發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)(圖3C)。

Zheng等[78]采用光刻技術(shù)在聚乙烯對(duì)苯二酸酯(PET)基質(zhì)上先后蒸發(fā)濺射一層鉻層和金層，制作出3個(gè)不同尺寸的金參比電極和5個(gè)不同尺寸的金工作電極，可通過(guò)改變工作電極和參比電極的尺寸大小和兩者之間的距離，對(duì)電化學(xué)阻抗測(cè)試操作條件進(jìn)行優(yōu)化；之后將生物相容性良好、穩(wěn)定性良好的聚吡咯(ppy)修飾到金電極表面，增強(qiáng)金電極對(duì)生物被膜粘附能力。將聚碳酸酯電化學(xué)流動(dòng)池和包含電極的基質(zhì)材料進(jìn)行組裝，實(shí)現(xiàn)外部培養(yǎng)基及菌液的注入，對(duì)銅綠假單胞菌的生物被膜進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)232h的原位阻抗信號(hào)監(jiān)測(cè)，用等效電路模型進(jìn)行擬合計(jì)算，發(fā)現(xiàn)修飾聚吡咯的金電極與未修飾的金電極相比，對(duì)等效電路中的電荷轉(zhuǎn)移阻抗Rct具有更高的靈敏度(圖3A)。

Pires等[79]設(shè)計(jì)了基于金電極陣列的多通道微流控芯片，該芯片由1條上游參比通道和1條下游測(cè)量通道構(gòu)成，測(cè)量通道中4個(gè)相同的金工作電極可同時(shí)監(jiān)測(cè)銅綠假單胞菌生物被膜的發(fā)展變化引起的阻抗信號(hào)，這既可減少因局部環(huán)境不同造成的實(shí)驗(yàn)誤差，又可實(shí)現(xiàn)多通道的并行檢測(cè)。他們利用此芯片對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜進(jìn)行了原位實(shí)時(shí)阻抗監(jiān)測(cè)，并通過(guò)測(cè)試通道內(nèi)電流隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化情況評(píng)估生物被膜內(nèi)細(xì)菌的生活狀態(tài)。此外，還評(píng)價(jià)了殺菌劑疊氮化鈉的殺菌效果及對(duì)生物被膜的清除效果，由阻抗測(cè)試和電流測(cè)試結(jié)果，得出疊氮化鈉有一定的殺菌效果，但不能完全瓦解已形成的生物被膜(圖3B)。

近年來(lái)，在微流控芯片微通道里利用叉指微電極開(kāi)展了基于電化學(xué)阻抗檢測(cè)生物被膜的生長(zhǎng)情況。Settu等[80]采用微機(jī)電加工技術(shù)將4個(gè)相同的叉指微電極集成到玻璃基片上，再使用硅橡膠粘合劑將聚苯乙烯腔體整合到基片上部，實(shí)現(xiàn)外部培養(yǎng)液及菌液的引入，對(duì)含大腸桿菌尿液樣本進(jìn)行了12h的監(jiān)測(cè)，利用等效電路模型分析了隨細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)所導(dǎo)致的阻抗信號(hào)的變化情況，發(fā)現(xiàn)Cdl隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)顯示出減少趨勢(shì)，大腸桿菌的粘附及其生物被膜的形成是造成其變化的主要原因(圖3D)。Estrada-Leypon等[81]設(shè)計(jì)了用于金黃色葡萄球菌生物被膜原位實(shí)時(shí)檢測(cè)的微流控電化學(xué)阻抗芯片，該芯片基片包含兩種叉指微電極、參比電極、對(duì)電極以及測(cè)試K+、Na+的PE電極，芯片蓋片由聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料制作，其中兩種叉指微電極用于金黃色葡萄球菌生物被膜的阻抗測(cè)試。他們利用有限元法對(duì)矩形叉指電極的幾何尺寸進(jìn)行了優(yōu)化，并將優(yōu)化后的矩形叉指微電極與圓形叉指微電極獲得的生物被膜阻抗信號(hào)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)矩形叉指微電極的檢測(cè)靈敏度得到了提高，并將顯微觀測(cè)技術(shù)與阻抗技術(shù)相結(jié)合，同時(shí)觀測(cè)和檢測(cè)金黃色葡萄球菌生物被膜的生長(zhǎng)情況(圖3F)。

圖3微流控芯片電化學(xué)阻抗檢測(cè)生物被膜實(shí)例

生物被膜的形成會(huì)受到周圍環(huán)境因素的影響，如培養(yǎng)基、溫度等，滿足生物被膜生長(zhǎng)所需培養(yǎng)基的流動(dòng)狀態(tài)也會(huì)影響生物被膜的結(jié)構(gòu)[82-83]，在流動(dòng)狀態(tài)下形成的生物被膜與生物被膜造成感染的環(huán)境更加接近。利用微流控技術(shù)在流動(dòng)狀態(tài)下研究生物被膜的形成更有價(jià)值。Zarabadi等[84]將石墨工作電極及石墨參比電極剪切成長(zhǎng)條狀，再通過(guò)電沉積法制作金工作電極，將3個(gè)電極用雙面膠粘合于硅基片上，將聚二甲基硅氧烷(PDMS)澆筑到模具上制作出微通道再與含3個(gè)電極的硅基片貼合，成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)所需微流控芯片裝置(圖3E)。利用此微流控芯片裝置分別對(duì)流動(dòng)狀態(tài)下微通道拐角及中心處銅綠假單胞菌形成的生物被膜進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)65h的在線監(jiān)測(cè)，并采用等效電路模型對(duì)微通道拐角及中心處獲得的生物被膜阻抗信號(hào)進(jìn)行擬合分析，發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，微通道拐角及中心處擬合得到的生物被膜電容Cb均先增加后減少，生物被膜電阻Rb均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但相比微通道中心，微通道拐角處擬合得到的生物被膜電阻Rb較大，可能是由于兩處形成的生物被膜結(jié)構(gòu)存在差異。

綜上所述，不同的細(xì)菌種類成膜能力及其形成時(shí)間會(huì)存在差異，電化學(xué)阻抗是通過(guò)獲取生物被膜響應(yīng)的阻抗信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，阻抗信號(hào)本身不具有特異性。但是，不同的細(xì)菌生物被膜響應(yīng)的阻抗信號(hào)有所不同，我們可通過(guò)控制及優(yōu)化阻抗檢測(cè)的相關(guān)參數(shù)，由阻抗相關(guān)參數(shù)對(duì)不同種細(xì)菌形成的生物被膜進(jìn)行區(qū)分。電極的材料構(gòu)型及等效電路分析模型是應(yīng)用電化學(xué)阻抗檢測(cè)生物被膜的關(guān)鍵。相同細(xì)菌在不同的電極表面處生物被膜的形成情況也可能存在差異，對(duì)生物被膜檢測(cè)具有高靈敏度且易于粘附細(xì)菌的電極材料及電極結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)有待進(jìn)一步研究。針對(duì)不同的生物被膜阻抗檢測(cè)體系，會(huì)有不同的等效電路分析模型，且模型選擇不同，擬合得到的生物被膜相關(guān)電容及電阻結(jié)果也存在差異。細(xì)菌生物被膜的形成過(guò)程分為可逆粘附期、不可逆粘附期、成熟期及散播期，處于不同時(shí)期的生物被膜具有不同的結(jié)構(gòu)，因此不同時(shí)刻獲得的生物被膜阻抗譜圖呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化趨勢(shì)，等效電路擬合得到的生物被膜相關(guān)電容及電阻也會(huì)呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律，但目前的研究還未能清晰地由阻抗分析結(jié)果嚴(yán)格區(qū)分生物被膜所處的生長(zhǎng)周期。所以今后，深入解析生物被膜特征阻抗信號(hào)并建立生物被膜與阻抗分析結(jié)果的關(guān)聯(lián)模型是完善電化學(xué)阻抗檢測(cè)生物被膜研究的一個(gè)重點(diǎn)。微流控芯片具有便攜、易于功能化及集成化的特點(diǎn)，如何充分發(fā)揮微流控芯片本身的優(yōu)勢(shì)，并將其與電化學(xué)阻抗技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來(lái)應(yīng)用到生物被膜的檢測(cè)及生物被膜形成機(jī)制的研究中，是今后具有特色的研究方向之一。

3.總結(jié)及展望

自人類認(rèn)識(shí)到細(xì)菌不單是以個(gè)體的形式存在，還會(huì)以群體的方式即生物被膜的形式存在以來(lái)，生物被膜的研究就一直備受關(guān)注。生物被膜的形成既受到周圍環(huán)境因素的影響，又受到細(xì)菌內(nèi)基因的調(diào)控。細(xì)菌群感效應(yīng)是一種調(diào)節(jié)生物被膜形成的重要機(jī)制。當(dāng)前，生物被膜的檢測(cè)方法顯得尤為重要，它是解決由生物被膜引發(fā)院內(nèi)感染及食品污染等問(wèn)題的基礎(chǔ)。結(jié)晶紫染色、激光共聚焦(CLSM)顯微觀測(cè)等方法雖可對(duì)生物被膜的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，但不能滿足對(duì)生物被膜動(dòng)態(tài)形成過(guò)程的持續(xù)在線檢測(cè)。此時(shí)，電化學(xué)阻抗以其無(wú)標(biāo)、無(wú)損、原位持續(xù)在線檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用到生物被膜動(dòng)態(tài)形成過(guò)程的檢測(cè)中恰到好處。在生物被膜阻抗檢測(cè)中，電極的選擇是決定檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵，一方面，可對(duì)普通電極表面進(jìn)行化學(xué)修飾以提高生物被膜阻抗信號(hào)響應(yīng)靈敏度；另一方面，設(shè)計(jì)制作超靈敏微電極，并將微電極集成到微流控芯片中，合理布局微流控芯片功能區(qū)，即可提高生物被膜電化學(xué)阻抗檢測(cè)靈敏度，又可發(fā)揮出微流控芯片本身的優(yōu)勢(shì)，以實(shí)現(xiàn)生物被膜形成過(guò)程的高通量檢測(cè)。除此之外，微流控芯片微通道微環(huán)境中受外界干擾小，可對(duì)流體流速等條件進(jìn)行人為操縱，具有模擬人體內(nèi)環(huán)境的潛能,微流控芯片為電化學(xué)阻抗研究體內(nèi)生物被膜在肺部、腸道等部位的感染及生物被膜形成情況提供了良好的操作平臺(tái)。總之，將微流控芯片與電化學(xué)阻抗結(jié)合在生物被膜檢測(cè)方面較常規(guī)體系具有很大優(yōu)勢(shì)。今后，用于生物被膜阻抗檢測(cè)的高靈敏電極結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及電極修飾、滿足生物被膜在不同環(huán)境下檢測(cè)的微流控芯片設(shè)計(jì)是極具前景和重大意義的研究方向。

文獻(xiàn)：劉露露 等《生物被膜的形成及其電化學(xué)阻抗檢測(cè)》http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.170264

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