紙芯片微流控技術的發展及應用
紙芯片微流控(Paperbasedmicrofluidics)或微流控紙基分析設備(Microfluidicpaper-basedanalyticaldevices，μPADs)簡稱紙芯片，是微流控芯片中的最新發展領域，由Whitesides研究組［4］在2007年首次提出。紙芯片是以紙代替傳統的石英、玻璃、硅、高聚物等材料，在紙的表面加工出具有一定結構的微流體通道的微型分析器件，結合了微流控技術和紙的優點。與傳統的微流控芯片相比，紙芯片具有以下優勢［5－9］:①紙來源豐富，可進行批量生產;②不需要外接泵，紙的主要成分是纖維素，流體在紙上通過毛細作用流動;③試樣消耗量更低;④檢測背景低，有利于光度法檢測;⑤生物兼容性好，可通過化學修飾改變紙的性質;⑥一次性便攜式分析，操作簡便，甚至不需要專業的操作人員。紙芯片為臨床診斷、環境監控以及食品安全分析中需要的便攜式檢測和現場實時監測提供了一個廣闊的平臺。此外，對于醫護人員和醫療設備緊缺的欠發達地區，紙芯片是低成本、檢測迅速的即時診斷(Point－of－caretesting，POCT)的有力工具。
紙芯片的發展可追溯到17世紀，英國化學家羅伯特·波義耳偶然發現石蕊地衣中提取的紫色浸液遇酸變紅色，遇堿變藍色，并利用這一特點制成了酸堿試紙———石蕊試紙。1949年，Müller及其同事用石蠟浸漬濾紙形成一定的通道，發明了用于洗脫色素的紙上薄層色譜［10］。從此以紙為載體的分析診斷設備開始出現。其中，以驗孕棒為代表的免疫色層分析試紙，即側向層析檢測(Lateralflowassays，LFAs)［11］是紙芯片技術發展中的一塊里程碑。市面上陸續出現用于檢測糖尿病、病原體生物標志及其他傳染病的紙基即時診斷設備［12－13］。這類檢測主要包括樣品墊、結合墊、檢測墊以及吸收墊。具體原理是向樣品墊加樣后，樣品溶液在毛細作用下流經結合墊，預先加入并干燥的帶有信號指示劑的抗體和目標抗原結合，形成抗原/信號－抗體結合物，共同流向檢測墊，隨后和固定在檢測墊表面的捕獲抗體結合，從而獲得信號輸出。吸收墊用于吸收樣品溶液，從而可以增加進樣量進而提高檢測的選擇性。其中，彩色乳膠微球或金納米顆粒常被作為信號分子［14］。此類試紙檢測因操作簡單、成本低且攜帶方便而取得了巨大成功。然而，側向層析檢測對樣品量需求大，且不適用于多重分析和定量分析［15］。而紙芯片的出現突破了傳統試紙檢測的局限，使低成本、低耗樣量的便攜化定量檢測成為了可能。圖1羅列了紙芯片發展過程中的里程碑事件。圖2為不同時期的紙基芯片示意圖。
圖1紙芯片微流控技術發展的里程碑事件
一、紙芯片的制作
紙芯片制作的基本原理是在紙面上形成通道從而實現對流體的引導。根據形成通道的方法不同可以分為以下幾類:直接切割制成通道;在濾紙上修飾諸如石蠟、光刻膠、烷基烯酮二聚體等疏水性材料形成通道;使用聚二甲硅氧烷、聚苯乙烯或聚亞胺酯等聚合物來封閉多孔結構從而形成物理屏障。其中，在濾紙上用疏水性材料形成通道是目前最常用的方法，但該方法不適于含有膽固醇等親油性物質的試樣。
除了濾紙外，根據不同需要，其他類型的紙也可以被用作紙芯片的基底。例如，硝化纖維膜對生物分子有較高的非特異吸附，適合固定DNA［24］、酶［16］以及蛋白質［25］等生物分子;蠟光紙韌性好、降解性低、表面光滑，可在其表面固定納米粒子［26］;紙巾的吸水性強，固定凝聚血細胞效果好［27］。
1.常用的制作方法
手工加工
①蠟畫 Lin等嘗試直接用蠟筆繪制圖案以及用蠟筆臨摹打印出的圖案這兩種方法該方法簡單省時，不需要昂貴的儀器并且無需專業人員操作，但僅適用于圖形簡單的紙芯片制作。
②聚合物油墨繪畫或壓印Whitesides等先將光膠涂在濾紙上，然后貼上透明膠帶，用筆直接在膠帶上繪制圖案，經紫外光照射后再撕下透明膠帶，得到印有圖案的紙芯片(圖3B)。該方法不需要使用模具，簡化了傳統的光刻制作法。
③石蠟壓印DeTarsoGarcia等使用金屬印戳在涂滿石蠟的濾紙上一步制成樹枝狀的紙芯片圖案，進一步用比色法進行檢測(圖3C)。該方法快速省時，成本低且可以大批量生產。
模具加工
①石蠟浸漬Laiwattanapaisal等將鐵制模具放置于平鋪在載玻片的濾紙上，并在載玻片的背面放上一塊磁鐵，然后浸入液態蠟中，待冷卻后再取出濾紙，從而得到相應圖形(圖3D)。該方法成本低，但需要模具，并且難以控制浸漬蠟的時間，重現性較差。
②光刻法Whitesides課題組［4］最早利用光刻法制作紙芯片。將SU－8光膠涂在濾紙表面并甩勻后，利用紫外燈照射，根據透明模具的形狀對光膠進行聚合，形成通道，再洗去未交聯的光膠，從而得到高分辨圖案(圖3E)。該成果是紙芯片研究領域的一大突破，為簡便、廉價以及可攜帶的檢測應用提供了一種可能。但光刻制作步驟繁瑣，成本高并易受背景影響。
③石蠟絲網打印Henry等［32］在絲網印刷模具上印上石蠟固體，然后加熱融化，形成疏水阻擋層，從而制得紙芯片(圖3F)。該方法成本低，操作方便，可批量生產，但石蠟在紙上不均勻的沉積會導致分辨率較低。
打印
①石蠟打印石蠟打印法是目前最常用的方法，由Lin等首次報道，Whitesides等進一步建立了石蠟在濾紙表面加熱融化的速率計算模型。具體操作為先用石蠟打印機打印預先設計的圖案，然后加熱使石蠟融化滲透至濾紙中，形成疏水阻擋層(圖3G)。其中，XeroxPhaser8560N石蠟打印機使用最廣泛，其石蠟墨在120℃開始融化，便于后續的加熱操作。該方法快速(5min內完成)、簡單、成本低(打印一張8.5英寸×11英寸WhatmanNo.1濾紙的成本為0.60美元)，特別適于大批量生產對分辨率要求不高的紙芯片。
②噴墨侵蝕Citterio等先用聚苯乙烯浸潤濾紙，然后將甲苯反復打印在特定區域以除去表面的聚苯乙烯，從而形成親水通道，再在相應區域打印化學或生物試劑，用于后續檢測(圖3H)。該方法能夠在繪制圖案的同時固定反應試劑，但不適合批量生產。
③噴墨打印Li等［23］先用噴墨打印機在設計的圖案上打印AKD材料以將濾紙部分疏水化，然后再加熱，確保打印區域完全疏水化，從而形成通道(圖3I)。此方法不需要模具，可批量生產。
④柔印Erho等［34］通過柔印打印將聚苯乙烯滲入濾紙，形成疏水壩，而未被打印的區域依然保持親水性，從而形成通道(圖3J)。該方法雖然快速，可批量生產，但加工過程復雜，需要不斷重復以確保通道完全疏水化。
切割
①工藝刀切割工藝刀切割［35］是利用電腦控制刀，根據不同的切割力度和角度制作相應的圖案，但通常要在底部加上保護層以避免濾紙被割破(圖3K)。與手工切割方法相比，該方法不僅提高了分辨率，還在制作時間和生產數量方面有了進一步優化。
②激光切割激光切割［36－38］(圖3L)不需要在底部加上保護層，但制備成本大，需要專門的激光切割儀器。Crooks等［39］利用激光切割法將設計的通道切除，形成中間鏤空的夾心型紙芯片傳感器，大大提高了流體在紙芯片的流動速度。
圖3紙芯片的制作方法原理圖
2.3D紙芯片
傳統的2D紙芯片無法實現高通量、多靶標、多步反應的檢測，并且容易產生試劑的交叉污染。而3D紙芯片的出現突破了2D紙芯片的局限，能夠集成復雜的網絡通道，并實現樣品的快速分配等。3D紙芯片具有多層結構，其常用的制作方法有兩種，利用雙面膠將平面圖案多層疊加固定或手工折疊。
Whitesides等用雙面膠固定多層印有不同圖案的紙，設計了一個用于同時檢測葡萄糖和蛋白質的3D紙芯片。該紙芯片的最上層有4個加樣口，底部含有16個檢測區。加入待測樣品后，樣品在毛細作用下達到最底層，與檢測區預先加入的試劑反應，產生肉眼可直接觀察的顏色變化。該設計將復雜的反應通道隱藏在裝置中，只呈現最終的檢測區域，便于結果的讀取和分析(圖4A，B)。而Crooks等［21］利用折紙的方法，同時用比色法和熒光法檢測葡萄糖和蛋白質。該設計的優勢在于3D結構的紙芯片可以隨時還原至平面結構，并任意一層進行定量或半定量分析(圖4C)。此外，Lewis等［43］發明了一種快速批量制作3D紙芯片的方法，先用石蠟打印機批量制作平面圖案，然后用噴霧膠粘貼一層空白濾紙，打印新的圖案，再重復以上步驟。此方法可一次性制造200～300個3D紙芯片，簡單高效。
圖4 3D紙芯片示意圖
二、基于紙芯片的檢測方法
紙芯片常用的檢測方法主要有光度檢測法、熒光法、化學發光、電化學發光法，以及電化學檢測法。其中，光度檢測法和電化學方法目前應用最為廣泛。
光度檢測法
光度檢測法是最直觀、最常用的一種方法。該方法通過顯色反應，如酶聯反應、基于納米粒子或量子點的顏色變化，將待測物質轉化為有顏色的物質，根據顏色變化的程度和待測樣品濃度的關系，進行半定量或者定量分析。可利用肉眼觀察進行半定量分析，但通常會因為不同檢測者的視覺感官不同而產生誤差。因此需進一步借助掃描儀、相機將檢測結果轉為圖片，然后用ImageJ、PS等圖像處理軟件將顏色轉化為灰度值，再根據灰度值和待測物濃度的關系進行定量分析。該方法的局限在于易受光線的影響，靈敏度和選擇性不及電化學方法。目前，光度檢測法主要用于：生物分子、離子、血液標本等。
熒光法
熒光法的選擇性好、檢出限低，但需要借助外接儀器，并受紙中熒光素產生的背景干擾。據文獻報道，利用熒光法可在紙芯片上檢測蛋白質、細菌］以及DNA。
化學發光法
化學發光法是根據化學反應在某個時刻發射的光強度來確定反應中某一組分濃度的方法。該方法靈敏度高、設備簡單、成本低、線性范圍寬、重現性好，可在黑暗環境中操作并可結合微加工技術進行分析。
電化學發光法
電化學發光法是將化學發光法與電化學技術相結合的一種新型技術，利用電化學反應進行發光，光學背景信號低、反應可控性強，通過控制電極電位可調節檢測的選擇性，具有良好的應用前景。
電化學方法
電化學方法的靈敏度高、選擇性好，檢測區不受光線的影響，耗樣量少，成本低，易于集成，并且技術成熟，已被廣泛應用于葡萄糖、膽固醇、維生素C、DNA及核酸、離子及氣體等物質的檢測。
紙芯片微流控技術因其廉價、高效、耗樣量少、便攜、制作簡單、操作方便等優勢引起廣泛關注，其設計符合世界衛生組織(WHO)針對在欠發達地區使用的診斷設備提出的“ASSUＲED”原則［98］，并已被廣泛應用。近年來，紙芯片手機［16］等移動設備的結合促進了遠程醫療以及家庭護理的發展。該體系的優點在于提高了即時診斷的便攜性和普遍性，使現場采集的數據能夠通過移動設備傳送到分析中心，從而避免了試樣運輸帶來的麻煩。迄今為止，紙芯片與移動設備聯用體系已經成功用于噬菌體和細菌病原體［99－100］、藥物［101］、生物標記物［51，102］、有毒金屬［103］以及爆炸物［104］等物質的檢測。但該體系易受外界光線影響，導致圖案色彩強度前后不一致。為了解決此問題，許多課題組開始設計手機圖像校正軟件［105］或擋光器件［106］。
作為一門新型技術，紙芯片微流控領域還有許多課題有待研究，如:開發更多類型的紙芯片擴大其應用范圍;尋找更簡單、廉價的制作方法;將紙芯片和新型材料結合增強生物兼容性以實現紙芯片的商品化;研究流體在紙芯片上的驅動機理，實現更精準的控制;與更多的檢測方法結合;延長試劑在紙芯片上的儲存時間及紙芯片的壽命;與檢測儀器集成實現便攜化檢測;提高紙芯片檢測的重現性和檢出限;優化檢測結果的輸出形式使紙芯片方便非專業人士的使用;減小外界環境對檢測的影響等。
通過不斷的優化，紙芯片微流控將不局限于欠發達地區的醫療診斷，還可以為發達地區的現場急救、臨床試驗、醫療保健提供低成本的診斷途徑，并在臨床診斷、食品安全分析以及環境監控等領域有著良好的發展前景。
文獻：紙芯片微流控技術的發展及應用（田 恬，黃藝順，林冰倩，魏曉峰，周雷激，朱 志，楊朝勇*） doi: 10. 3969 / j. issn. 1004 － 4957. 2015. 03. 002
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